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可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备
被引量：
11
1
作者
杨兵
何金生
+7 位作者
石长信
张梅
虞结梅
谢灿
陆燕燕
付远辉
彭向雷
洪涛
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第4期682-685,共4页
构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV...
构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。
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关键词
辅助病毒依赖型腺病毒载体
人呼吸道合胞病毒融合蛋白
逆转录聚合酶链式反应
免疫印迹
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职称材料
人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性
被引量：
5
2
作者
傅生芳
朱传凤
+3 位作者
姜英
安静
余黎
周旭
《微生物学免疫学进展》
2015年第3期21-25,共5页
目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不...
目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。
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关键词
呼吸道合胞病毒截断短
f
1蛋白
包涵体
纯化
复性
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职称材料
题名
可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备
被引量：
11
1
作者
杨兵
何金生
石长信
张梅
虞结梅
谢灿
陆燕燕
付远辉
彭向雷
洪涛
机构
安徽医科大学免疫学教研室
Division of Hematology-Oncology
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
北京交通大学生物科学与技术研究所
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第4期682-685,共4页
基金
国家自然科学基金(30671965)~~
文摘
构建可表达A亚型人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytialvirus,RSV)融合蛋白(fusion protein,F)的辅助病毒依赖型腺病毒载体(helper-dependent adenoviral vector,HDAd),并完成大量制备、纯化和F蛋白的体外表达鉴定。将带有CMV启动子序列的F基因亚克隆至克隆载体pSC11,鉴定正确后,克隆至HDAd质粒pSC15B,构建pSC15B/F HDAd重组质粒,PmeⅠ消化pSC15B/F去除原核复制元件及抗性基因,获得HDAd/F DNA分子,经磷酸钙共沉淀法转染293Cre4细胞,16h后感染辅助病毒,收获HDAd/F载体粗提液,随后以HDAd/F粗提液及辅助病毒连续共感染293Cre4细胞直至HDAd/F达到复制极限,同时以可表达β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)报告基因的HDAdLacZ载体作为平行对照监测载体复制过程。与辅助病毒共感染293Cre4细胞进一步扩增HDAd/F、CsCl梯度法超速离心制备大量纯化的HDAd/F载体,体外感染293细胞,RT-PCR检测到F基因有转录,Western blot分析表明F蛋白有特异性表达。总之,成功构建HDAd/F载体并在真核细胞中实现表达,为体内免疫学效力试验奠定基础,为研制RSV疫苗提供了一种新方法。
关键词
辅助病毒依赖型腺病毒载体
人呼吸道合胞病毒融合蛋白
逆转录聚合酶链式反应
免疫印迹
Keywords
helper-dependent
adenoviral
vector
f
protein
o
f
human
respiratory
syncytial
virus
RT-PCR
Western
blot
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
Q93
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职称材料
题名
人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性
被引量：
5
2
作者
傅生芳
朱传凤
姜英
安静
余黎
周旭
机构
兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程研究中心
出处
《微生物学免疫学进展》
2015年第3期21-25,共5页
文摘
目的将前期在大肠埃希杆菌中获得表达的A型人呼吸道合胞病毒兰州分离株截短的F1重组蛋白进行纯化和复性,为后期动物免疫制备抗原。方法 37℃诱导重组菌体p ET-42b-F1J/Rossata,诱导完毕后离心收集菌体,高压破碎菌体并收集包涵体后用不同浓度的Triton X-100(细胞裂解液)洗涤包涵体3次。洗涤的包涵体用8 mol/L尿素进行溶解并用镍离子亲和层析方法进行初步纯化,用阳离子交换层析方法对初步纯化蛋白进行最终的纯化。亲和层析纯化蛋白用3种不同的复性液进行了稀释复性。结果 37℃诱导5 000 m L重组菌p ET-42b-F1J/Rossata共收获37 g湿菌体,经过不同浓度Triton X-100洗涤包涵体后纯度可达75%。包涵体用8 mol/L尿素溶解后经镍离子亲和层析纯化纯度约为40%,再用阳离子交换层析介质SP HP进一步纯化样品后纯度可达90%。纯化蛋白以3种不同的复性液都能得到复性,其中复性液3的复性效果相对较好。结论实验中探索了人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的纯化方法及步骤,为后期的蛋白制备及动物免疫奠定了基础。
关键词
呼吸道合胞病毒截断短
f
1蛋白
包涵体
纯化
复性
Keywords
f
1
truncated
protein
o
f
human
respiratory
syncytial
virus
Inclusion
body
Puri
f
ication
Renaturation
分类号
R392 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备
杨兵
何金生
石长信
张梅
虞结梅
谢灿
陆燕燕
付远辉
彭向雷
洪涛
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007
11
下载PDF
职称材料
2
人呼吸道合胞病毒截短F1重组蛋白包涵体的制备、纯化和复性
傅生芳
朱传凤
姜英
安静
余黎
周旭
《微生物学免疫学进展》
2015
5
下载PDF
职称材料
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0
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