期刊文献+
共找到4,295篇文章
< 1 2 215 >
每页显示 20 50 100
植物基因工程表达载体的改进和优化策略 被引量:54
1
作者 侯丙凯 夏光敏 陈正华 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期492-497,共6页
外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究者困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担忧。本文简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略 ,这些策略有助于增强外源基因的表... 外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究者困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担忧。本文简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略 ,这些策略有助于增强外源基因的表达水平、提高生物工程体的安全性。 展开更多
关键词 植物 转基因 表达载体 优化 改进
下载PDF
大肠杆菌表达系统的研究进展 被引量:42
2
作者 戎晶晶 刁振宇 周国华 《药物生物技术》 CAS CSCD 2005年第6期416-420,共5页
近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二... 近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。 展开更多
关键词 大肠杆菌表达系统 表达载体 宿主细胞 重组蛋白
下载PDF
一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用 被引量:34
3
作者 罗文新 张军 +5 位作者 杨海杰 李少伟 谢小燕 逄淑强 李少菁 夏宁邵 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第5期578-581,共4页
构建的 pTO T7大肠杆菌高效融合表达载体 ,调控序列中有一个Ω序列和一个T7启动子串联 ;多克隆位点 (MCS)包括 8个常用酶切位点 ;可进行融合表达或者非融合表达 ,根据不同的需要加以选择 ;融合蛋白N端为T7g10的 12个起始氨基酸 ,C端为Hi... 构建的 pTO T7大肠杆菌高效融合表达载体 ,调控序列中有一个Ω序列和一个T7启动子串联 ;多克隆位点 (MCS)包括 8个常用酶切位点 ;可进行融合表达或者非融合表达 ,根据不同的需要加以选择 ;融合蛋白N端为T7g10的 12个起始氨基酸 ,C端为His标签 ;含kan抗性基因作为选择标记。将增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因克隆至 pTO T7载体 ,在E .coli中的表达结果表明 ,融合EGFP达到菌体总蛋白量的 5 0 %以上 ,90 %以上的融合蛋白以可溶性形式存在 ,融合后的EGFP仍保持原有的荧光性质。与同时构建的不含Ω序列的 pT T7载体的表达产量的比较研究结果表明 ,Ω序列在 pTO T7载体中能显著提高表达效率。 展开更多
关键词 增强子 原核细胞 表达载体 PTO-T7 Ω序列
下载PDF
改造稀有密码子提高SEA蛋白表达量 被引量:21
4
作者 时成波 吕安国 +3 位作者 吴文芳 杨立泉 冯家勋 柏学亮 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期477-480,共4页
利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇 ,将此段中稀有密码子全部更换成E .coli最常用密码子 ,得到seam 。将sea和seam 分别克隆于 7ZTS表达载体上 ,并转化JM10 9(DE3)菌株。结果表明 ,sea基因的表达十分微弱 ,而seam 基因的... 利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇 ,将此段中稀有密码子全部更换成E .coli最常用密码子 ,得到seam 。将sea和seam 分别克隆于 7ZTS表达载体上 ,并转化JM10 9(DE3)菌株。结果表明 ,sea基因的表达十分微弱 ,而seam 基因的表达量十分高 ,约占菌体总蛋白的 15 %。表达产物在体内具有一定的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 改造 稀有密码子 SEA蛋白 表达量 表达载体
下载PDF
水稻雄性不育及其育性恢复表达载体的构建 被引量:19
5
作者 张晓国 刘玉乐 +2 位作者 康良仪 朱英国 田波 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期629-634,共6页
将PCR扩增获得的水稻花药绒毡层特异表达基因Osg6B启动子(简写成6B)与来自质粒pROKⅡ上的NOS终止子相连,产生了pGEM7Z-6BNOS。然后将来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylodique faciens)中的Barnase和Barstar基因(简写成BN和BS)分别插入到... 将PCR扩增获得的水稻花药绒毡层特异表达基因Osg6B启动子(简写成6B)与来自质粒pROKⅡ上的NOS终止子相连,产生了pGEM7Z-6BNOS。然后将来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylodique faciens)中的Barnase和Barstar基因(简写成BN和BS)分别插入到pGEM7Z-6BNO上的BamH I和Nco I位点上,再用Sal I和Xho I切下2.3 kb的6BBNNOS相2.2kb的6BBSNOS片段,并分别将其插入到pDM302的Xho I位点上,经酶切分析表明6BBNNOS和6BBSNOS在pDM302上的方向相反。从而成功地构建了水稻雄性不育和其育性恢复表达载体pDM302-6BBNNOS和pDM302-6BBSNOS。用基因枪轰击水稻幼胚,获得了抗膦化麦黄酮(PPT)的水稻转基因植株,可望形成优良的水稻雄性不育和育性恢复系,以应用于生产。 展开更多
关键词 雄性不育 育性恢复 表达载体 水稻 杂交水稻
下载PDF
用于叶绿体遗传转化的表达载体 被引量:22
6
作者 侯丙凯 于惠敏 夏光敏 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期100-103,共4页
叶绿体遗传转化是植物基因工程的新方向。本文简要介绍用于叶绿体遗传转化的表达载体的构建方法 ,涉及同源重组片段、叶绿体特异的启动子和终止子、筛选标记基因 ,以及目前在叶绿体中已实现表达的外源基因等内容。
关键词 叶绿体 遗传转化 表达载体
下载PDF
酿酒酵母表达系统 被引量:16
7
作者 唐香山 张学文 《生命科学研究》 CAS CSCD 2004年第S1期106-109,共4页
酿酒酵母是单细胞真核微生物,人们以酿酒酵母为宿主菌,用载体表达外源基因的过程中,积累了丰富的经验,掌握了酿酒酵母表达的许多优缺点,如它繁殖速度快,可以大规模发酵生产,但在发酵过程中会产生乙醇,而乙醇在培养基中积累会影响酵母的... 酿酒酵母是单细胞真核微生物,人们以酿酒酵母为宿主菌,用载体表达外源基因的过程中,积累了丰富的经验,掌握了酿酒酵母表达的许多优缺点,如它繁殖速度快,可以大规模发酵生产,但在发酵过程中会产生乙醇,而乙醇在培养基中积累会影响酵母的生长代谢和基因产物的表达,尤其是进行高密度发酵时该效应更明显;针对这些缺点,可以采取积极的应对措施.主要就酿酒酵母表达系统的组成、优缺点及高效表达的策略等作一综述. 展开更多
关键词 酿酒酵母 表达 载体 蛋白质
下载PDF
新型酵母表达系统的研究 被引量:7
8
作者 张平武 李育阳 《生物技术通讯》 CAS 1999年第4期306-309,共4页
酵母表达系统是在酿酒酵母质粒的发现和酵母转化技术的成熟基础上建立起来的真核生物表达系统。许多有应用价值的外源基因成功地在其中表达,但也存在一些局限性。为了开发新的酵母表达系统,人们在酿酒酵母以外的酵母中寻找合适的宿主... 酵母表达系统是在酿酒酵母质粒的发现和酵母转化技术的成熟基础上建立起来的真核生物表达系统。许多有应用价值的外源基因成功地在其中表达,但也存在一些局限性。为了开发新的酵母表达系统,人们在酿酒酵母以外的酵母中寻找合适的宿主以建立新的载体-宿主系统。本文综述了建立新的酵母表达系统涉及的有关问题和近几年来的研究进展。 展开更多
关键词 酵母 表达系统 宿主菌 载体
下载PDF
甘蓝型油菜fad2基因片段的克隆和反义表达载体的构建 被引量:14
9
作者 熊兴华 官春云 +3 位作者 李栒 王学军 周小云 李家洋 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期1-4,共4页
从甘蓝型油菜湘油 15号基因组中分离总DNA ,以此为模板进行多聚酶链式反应 (PCR)。PCR产物与克隆载体 pGEM -TEasy连接 ,经NotI酶切后插入 pBluescriptIISK +。序列测定表明 ,PCR产物为 6 5 4bp的DNA片段 ,fad2基因片段只朝 pBluescript... 从甘蓝型油菜湘油 15号基因组中分离总DNA ,以此为模板进行多聚酶链式反应 (PCR)。PCR产物与克隆载体 pGEM -TEasy连接 ,经NotI酶切后插入 pBluescriptIISK +。序列测定表明 ,PCR产物为 6 5 4bp的DNA片段 ,fad2基因片段只朝 pBluescriptIISK +的T3-T7方向插入 ,经BamHI和SacI酶切后插入表达载体质粒pBI12 1相同的酶切位点 ,构建反义 fad2表达载体。 展开更多
关键词 FAD2基因 反义表达载体 甘蓝型油菜 PCR 基因克隆
下载PDF
phbB、phbC基因在大肠杆菌中的表达及对马铃薯植株的转化和检测 被引量:14
10
作者 雍伟东 梁铁兵 +2 位作者 谢安勇 李枞 宋艳茹 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 1998年第7期615-621,共7页
利用从真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)H16染色体DNA中克隆到的催化聚β羟基丁酸酯(polyβhydroxybutyrate,PHB)生物合成的两个关键酶基因:依赖NADPH的乙酰乙... 利用从真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)H16染色体DNA中克隆到的催化聚β羟基丁酸酯(polyβhydroxybutyrate,PHB)生物合成的两个关键酶基因:依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)以及PHB合酶基因(phbC),同时利用大肠杆菌高效表达载体pKK2233,构建了嵌合有phbB和phbC基因的表达载体pKCB,转入大肠杆菌JM109,通过显微镜观察及气相色谱分析检测PHB的合成。在确证克隆基因正确的基础上构建了马铃薯块茎特异性表达载体pPSAGB(含phbB基因)、pBIBGC(含phbC基因)和pPSAGCB(含phbB和phbC双基因),转化5个马铃薯品种,经检测获得20个转基因阳性株系。 展开更多
关键词 聚羟基丁酸酯 表达载体 转基因马铃薯 检测
下载PDF
GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化 被引量:10
11
作者 柴红梅 张绍松 +2 位作者 万萌 赵永昌 黄兴奇 《西南农业学报》 CSCD 2002年第4期35-37,共3页
将带有启动子GaMV35S、终止子Nos ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α PAP上,构建成双抗表达载体pBI121/GNA+α PAP,并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元,获得了卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR... 将带有启动子GaMV35S、终止子Nos ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α PAP上,构建成双抗表达载体pBI121/GNA+α PAP,并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元,获得了卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,烟草基因组中含有这两个抗性基因。 展开更多
关键词 GNA α-PAP 双抗表达载体 烟草 遗传转化 雪花莲凝集素 商陆抗病毒蛋白 表达载体构建
下载PDF
乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景 被引量:14
12
作者 王庆忠 李国荣 +2 位作者 尹昆 张会亮 李云龙 《生命科学》 CSCD 2005年第1期76-81,共6页
转基因动物乳腺生物反应器是伴随转基因动物技术而发展起来的一项高新生物技术。利用这项技术,我们可以从动物乳汁中源源不断地获取用于医疗或保健目的的有生物活性的基因产物。这是一种全新的蛋白质生产模式,它将成为许多国家的重要支... 转基因动物乳腺生物反应器是伴随转基因动物技术而发展起来的一项高新生物技术。利用这项技术,我们可以从动物乳汁中源源不断地获取用于医疗或保健目的的有生物活性的基因产物。这是一种全新的蛋白质生产模式,它将成为许多国家的重要支柱产业之一。本文介绍了乳腺生物反应器的基本概念和基本原理;概述了制备过程中的目的基因选择、载体构建、转基因等技术环节的研究现状;分析了乳腺生物反应器的优势及存在的问题,并就其产业化前景进行了展望。 展开更多
关键词 转基因动物 乳腺生物反应器 表达载体 转基因技术
下载PDF
人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达 被引量:17
13
作者 夏小兵 成军 +5 位作者 王刚 杨继珍 刘妍 董菁 王琳 李克 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第7期743-746,共4页
目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver,regeneration,hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1... 目的从人胎肝cDNA文库中克隆出人肝再生增强因子(human augmenter of liver,regeneration,hALR),并实现hALR在毕赤酵母中的表达方法利用PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,亚克隆到pPIC9K的α因子下游并置于AOX1启动子控制下,构建成含有ALR基因的酵母表达载体转化酵母细胞后,挑选出能在浓度为4.0g·L^(-1)的G418平板上生长的His^+的重组酵母,利用PCR鉴定是否插入了hALR基因.重组酵母的表达在甲醇培养中进行,并利用SDS-PAGE分析hALR的表达.结果 PCR从胎肝cDNA文库中扩增出与文献报道序列一致的ALR cDNA,实现了其在酵母中的整和表达结论 hALR在毕赤酵母中的表达是可行的. 展开更多
关键词 人肝再生增强因子 肝再生 肝细胞生长因子 遗传学 毕赤酵母 基因表达 遗传载体
下载PDF
抗菌肽牛乳铁多肽素(LfcinB)在毕赤酵母中的表达及活性鉴定 被引量:15
14
作者 易俊波 黄德新 +1 位作者 李凌云 林枫 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期265-269,共5页
利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得... 利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。 展开更多
关键词 牛乳铁多肽素(LfcinB) 基因 表达载体 毕赤酵母表达系统
下载PDF
大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体的构建及内皮抑素基因的表达 被引量:14
15
作者 韩庆旺 徐叶芬 +4 位作者 傅更锋 张洪英 樊燕蓉 刘新卷 徐根兴 《生物技术通讯》 CAS 2006年第1期18-21,共4页
目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK(+)、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构... 目的:构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体,并通过此载体使人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中得到表达。方法:以质粒pDG7、pBCSK(+)、pET-9C为基础,构建大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达载体pET-1128,并将人内皮抑素基因插入到新构建的表达载体中,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和长双歧杆菌NQ-1501。诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。结果:成功构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭载体,人内皮抑素基因在大肠杆菌和长双歧杆菌中均可表达。结论:构建的穿梭载体为今后用双歧杆菌作为生理菌载体进行肿瘤的基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 双歧杆菌 大肠杆菌 穿梭载体 内皮抑素 表达载体 IPTG
下载PDF
乳腺生物反应器制备中表达载体的发展 被引量:8
16
作者 陈红星 杨晓 黄培堂 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期136-139,共4页
乳腺生物反应器拥有巨大的开发价值 ,但开发成功的例子却寥寥可数 ,主要的原因是外源基因的表达量较低 ,达不到开发生产的要求。提高外源基因表达量的关键在于乳腺生物反应器表达载体的构建。近年来 ,这方面的新思路、新方法不断出现 。
关键词 乳腺生物反应器 表达载体 转基因动物
下载PDF
农杆菌介导银杏遗传转化体系的建立及Gb-DXR基因表达载体的构建 被引量:17
17
作者 冯国庆 杨颖舫 +4 位作者 李郑娜 成瑜 杨春贤 陈敏 廖志华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第10期4992-4995,5067,共5页
[目的]为提高农杆菌介导的银杏遗传转化效率提供参考。[方法]以成熟的银杏种子胚为外植体,在无激素MS培养基上预培养48h后,采用3种农杆菌介导将GUS基因导入银杏胚中,经过组织化学染色法检测到GUS瞬时表达活性,对影响GUS基因表达的因素... [目的]为提高农杆菌介导的银杏遗传转化效率提供参考。[方法]以成熟的银杏种子胚为外植体,在无激素MS培养基上预培养48h后,采用3种农杆菌介导将GUS基因导入银杏胚中,经过组织化学染色法检测到GUS瞬时表达活性,对影响GUS基因表达的因素进行初步分析;并构建了银杏内酯前体合成途径上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的表达载体。[结果]该研究得到较合适的遗传转化方案,即用银杏胚作为外植体,用携带pCAMBIA1304+的EHA105农杆菌进行侵染,共培养3d,进行GUS染色,结果显示转化后GUS阳性率较高。[结论]该研究为进一步的银杏转基因研究工作奠定了基础。 展开更多
关键词 银杏胚 农杆菌介导 遗传转化 GUS基因 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR) 表达载体
下载PDF
家蚕丝胶蛋白基因1(ser-1)启动子的克隆及其活性分析 被引量:9
18
作者 诸戌娴 曹广力 +3 位作者 薛仁宇 周文林 刘炜彬 贡成良 《科技通报》 2007年第6期828-834,共7页
家蚕ser-1基因是中部丝腺中特异表达组织特异性基因。为研究家蚕ser-1基因在时空上的调控机制,用PCR的方法克隆了家蚕ser-1基因启动子并进行序列分析,进一步构建了由ser-1基因启动子驱动报告基因DsRed的新型表达质粒pSK-ser-DsRed-PolyA... 家蚕ser-1基因是中部丝腺中特异表达组织特异性基因。为研究家蚕ser-1基因在时空上的调控机制,用PCR的方法克隆了家蚕ser-1基因启动子并进行序列分析,进一步构建了由ser-1基因启动子驱动报告基因DsRed的新型表达质粒pSK-ser-DsRed-PolyA,并通过蚕体和家蚕BmN细胞进行了瞬时表达。结果显示,家蚕ser-1基因启动子的TATA框的保守序列为TATAAAA,位于-24~-30处,CAAT框位于-112~-115处;ser-1基因启动子可以驱动红色荧光基因DsRed在家蚕幼虫的中部丝腺组织和培养的BmN细胞中瞬时表达。 展开更多
关键词 家蚕 丝胶蛋白基因 启动子 克隆 表达载体
下载PDF
抗草甘膦基因表达载体的构建及对玉米的遗传转化 被引量:15
19
作者 李敬娜 刘亚 +2 位作者 李翔 袁潜华 赵久然 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第4期44-48,共5页
以pCambia3301载体为基础,以玉米Ubiquitin(Ubi)启动子、拟南芥叶绿素转运肽(Chloroplast transit pep-tide,Ctp)基因、抗草甘膦Epsps基因为元件,构建了玉米高效双元表达载体,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌... 以pCambia3301载体为基础,以玉米Ubiquitin(Ubi)启动子、拟南芥叶绿素转运肽(Chloroplast transit pep-tide,Ctp)基因、抗草甘膦Epsps基因为元件,构建了玉米高效双元表达载体,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导法转化玉米幼胚,获得了抗草甘膦无抗生素标记的转基因玉米植株。经田间初步检测转化玉米植株具有一定的草甘膦抗性。 展开更多
关键词 草甘膦 EPSPS 表达载体 玉米 遗传转化
下载PDF
RNA干扰及其植物抗病毒应用 被引量:15
20
作者 张恭 刘立峰 马峙英 《中国农学通报》 CSCD 2007年第1期42-45,共4页
【研究目的】RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是分子生物学研究领域的一项新兴技术,在动植物的遗传改良、功能基因组、基因治疗等研究中广泛应用;【方法】它是指一些小的双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象;【结果】本文就... 【研究目的】RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是分子生物学研究领域的一项新兴技术,在动植物的遗传改良、功能基因组、基因治疗等研究中广泛应用;【方法】它是指一些小的双链RNA分子介导的、序列特异的转录后基因沉默现象;【结果】本文就RNA干扰的作用机制、RNA干扰与植物病毒间的互作以及RNA干扰表达载体构建的一些研究进展进行了综述;【结论】随着RNAi研究的进一步深入,RNAi必将成为遗传育种工作者培育抗病毒植物的有力手段,促进植物抗病育种的发展。 展开更多
关键词 RNA干扰 植物抗病毒 表达载体
下载PDF
上一页 1 2 215 下一页 到第
使用帮助 返回顶部