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PcDNA3.1/hTM质粒对真核细胞转染表达的实验研究
1
作者 乔正荣 俞慎林 +1 位作者 戴毅 郭颖 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 2006年第12期917-919,共3页
目的探讨含有人血栓调节蛋白(hTM)基因的真核表达质粒pcDNA 3.1/hTM转染脐静脉内皮细胞(HUVECs)的抗凝效应。方法由阳离子脂质体介导将pcDNA 3.1/hTM质粒转入内皮细胞中,以RT-PCR法检测hTMmRNA的表达;免疫组化法检测hTM分子的表达。结... 目的探讨含有人血栓调节蛋白(hTM)基因的真核表达质粒pcDNA 3.1/hTM转染脐静脉内皮细胞(HUVECs)的抗凝效应。方法由阳离子脂质体介导将pcDNA 3.1/hTM质粒转入内皮细胞中,以RT-PCR法检测hTMmRNA的表达;免疫组化法检测hTM分子的表达。结果转染重组质粒的HUVECs表达的hTMmRNA约为载体质粒组及未转染组的1.7倍。免疫组化显示有平均1 0%的HUVECs获得转染,阳性细胞较阴性细胞hTM的表达强度有明显提高。结论pcDNA 3.1/hTM质粒能被导入HUVECs中表达,而且外源性hTM分子具有完全的抗凝生物学活性。 展开更多
关键词 PcDNA3.1/hTM质粒 真核细胞 基因表达 转染 血栓形成/治疗
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人LDH-B基因克隆及其真核表达载体的构建
2
作者 胡湘麟 卿鑫 曾凡才 《现代医药卫生》 2016年第20期3106-3108,3112,共4页
目的克隆人乳酸脱氢酶B(LDH-B)基因并构建其真核表达载体。方法提取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的总RNA,逆转录生成c DNA,以c DNA为模板,采用PCR扩增获得LDH-B基因编码区序列片段,限制性核酸内切酶Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切LDH-B基因片段及p U... 目的克隆人乳酸脱氢酶B(LDH-B)基因并构建其真核表达载体。方法提取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的总RNA,逆转录生成c DNA,以c DNA为模板,采用PCR扩增获得LDH-B基因编码区序列片段,限制性核酸内切酶Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切LDH-B基因片段及p UC19质粒,连接反应构建p UC19-LDH-B克隆载体,并将其转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选挑取白色菌落,酶切验证后测序鉴定。将序列正确的LDH-B基因亚克隆到pc DNA3.1(-)载体上,构建LDH-B真核表达载体pc DNA3.1(-)-LDH-B。结果PCR扩增后可见约1.0 kb的特异性条带,与预期的LDH-B片段长度相符合;Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切p UC19-LDH-B后可见约2.6 kb和1.0 kb的条带,分别与p UC19和LDH-B的片段长度相符合,LDH-B测序结果与DNA序列数据库(Genebank)中的参考序列相一致;Bam HⅠ和KpnⅠ双酶切pc DNA3.1(-)-LDH-B后可见约5.5 kb和1.0 kb的条带,分别与pc DNA3.1(-)和LDH-B的片段长度相符合。结论成功克隆了人LDH-B基因,并构建了其真核表达载体,为进一步探究LDH-B的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 L-乳酸脱氢酶 基因 克隆 分子 遗传载体 真核细胞
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重组人肿瘤坏死因子α分泌型真核表达载体的构建及表达
3
作者 赵亮 罗以勤 +4 位作者 姚丽娟 孔建新 濮跃晨 孙安源 张林杰 《临床输血与检验》 CAS 2009年第1期1-5,共5页
目的构建人肿瘤坏死因子rhTNF-α分泌型真核表达载体,并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达。方法以pGEM-T/sig-tumstatin为模板,扩增与TNF带重叠区的型胶原信号肽sig基因片段,以PBV220-TNF为模板,扩增与sig带重叠区的TNF基因片段,... 目的构建人肿瘤坏死因子rhTNF-α分泌型真核表达载体,并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达。方法以pGEM-T/sig-tumstatin为模板,扩增与TNF带重叠区的型胶原信号肽sig基因片段,以PBV220-TNF为模板,扩增与sig带重叠区的TNF基因片段,以上述2个扩增产物片段为模板,重叠区扩增拼接法(SOEing)扩增得到sig-TNF。sig-TNF片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRE Sneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定,对获得的sig-TNF基因片段及重组载体进行验证。将重组sig-TNF真核表达载体转染到CHO-K1,并对其表达状况进行检测。结果所获得的sig-TNF片段(558bp)序列与报道的序列完全一致,酶切鉴定结果表明含人肿瘤坏死因子的重组pIRE Sneo3/sig-TNF表达载体构建成功,转染重组pIRE Sneo3/sig-TNF的CHO-K1分泌表达了人肿瘤坏死因子rhTNF-α。转染了pIRE S-neo3/sig-TNF真核表达载体和空载体的CHO-K1和未转染CHO-K1细胞的生长速度没有差别。结论成功构建了重组人肿瘤坏死因子rhTNF-α分泌型真核表达载体,并获得能稳定表达rhTNF-α的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子Α 遗传载体 真核细胞 中国仓鼠卵巢细胞
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喉癌eIF4E基因的体外转录 被引量：1
4
作者 滕博 金春顺 +1 位作者 文连姬 崔树勋 《中国耳鼻咽喉颅底外科杂志》 CAS 2008年第4期251-254,共4页
目的克隆喉癌eIF4E基因编码区的cDNA序列,并构建其体外转录载体,获得eIF4E基因编码区mRNA,以便进一步的体外实验研究。方法利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以喉癌Hep-2细胞mRNA为模板,扩增获得全长eIF4E编码区cDNA,与pMD18T连接作全... 目的克隆喉癌eIF4E基因编码区的cDNA序列,并构建其体外转录载体,获得eIF4E基因编码区mRNA,以便进一步的体外实验研究。方法利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法,以喉癌Hep-2细胞mRNA为模板,扩增获得全长eIF4E编码区cDNA,与pMD18T连接作全自动测序,并利用基因重组技术构建eIF4E基因mRNA体外转录载体pGEM-7zf+eIF4E。用内切酶XhoI将含有eIF4E基因mRNA的pGEM-7zf+eIF4E质粒消化成线性,以此为模板体外转录出用[a-32P]UTP标记的靶eIF4E基因编码区mRNA。结果经测序证实获得的eIF4E基因cDNA序列与GeneBank一致,并成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E。结论成功构建了体外转录质粒pGEM-7zf+eIF4E,为进一步研究eIF4E的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 真核细胞翻译起始因子-4E 体外转录 逆转录多聚酶链反应 喉肿瘤
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