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pEGFP—N1-hPer2载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达 被引量：1
1
作者 程安源 郭卫春 +3 位作者 戢鹏 方硕 杨俭 余铃 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期737-740,共4页
目的构建人的生物钟基因Period2（hPer2）真核表达载体pEGFP-N1-hPer2，观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达。方法应用实时定量荧光反转录聚合酶链反应（FQ—PCR）技术从MG63细胞中扩增hPer2，并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP—N1的... 目的构建人的生物钟基因Period2（hPer2）真核表达载体pEGFP-N1-hPer2，观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达。方法应用实时定量荧光反转录聚合酶链反应（FQ—PCR）技术从MG63细胞中扩增hPer2，并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP—N1的多克隆位点，采用脂质体介导转染骨肉瘤细胞MC63，采用FQ-PCR和Westernblot分别检测hPer2的表达。结果重组质粒经PstI、KpnI双酶切和测序与hPer2基因序列一致，利用脂质体介导将pEGFP—N1-hPer2重组质粒成功转染到骨肉瘤细胞MG63中并获得了hPer2基因的过表达。FQ-PCR显示实验组（pEGFP—N1-hPer2组）的mRNA水平（7．84±1．17）明显高于空载体组（pEGFP—N1组，1．42±2．11）和空白对照组（1．21±1．61）；Westemblot显示实验组hPer2蛋白（0．382±1．131）的表达明显高于空载体组（0．178±2．110）和空白对照组（0．166±1．951），差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建pEGFP—N1-hPer2真核表达载体，并能够在骨肉瘤细胞MG63中过表达。 展开更多
关键词 生物节律 人生物钟基因Period2 骨肉瘤 MG63 真核表达载体pegfp—n1
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大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建 被引量：1
2
作者 张建红 刘艳霞 +2 位作者 王宝利 范海鸣 吴艳娜 《天津医科大学学报》 2007年第4期479-481,488,共4页
目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序... 目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 寡霉素敏感相关蛋白 克隆 pegfp—n1真核表达载体 大鼠
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组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定
3
作者 王璇 任娟 +5 位作者 张伯翔 于涛 蓝茜 李玥 吕社民 李冬民 《山西医药杂志（上半月）》 CAS 2011年第2期107-110,共4页
目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP... 目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。 展开更多
关键词 组蛋白脱乙酰基酶类 真核表达载体pegfp—n1 基因表达 重组质粒
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人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达 被引量：2
4
作者 钱进军 程言博 +2 位作者 刘春风 杨亚萍 刘康永 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期23-26,共4页
目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序... 目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、BamHI两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定。以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功。RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株。 展开更多
关键词 α-synuclein(SnCA) 致病突变 真核表达载体pegfp-C3 稳定转染 PC12细胞
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人NDRG2基因截短体在pEGFP-C2真核表达载体中的表达和鉴定 被引量：1
5
作者 王健 吴琳 +4 位作者 张健 刘学武 张璟 沈岚 刘新平 《现代生物医学进展》 CAS 2009年第4期631-633,共3页
目的:在pEGFP-C2真核表达载体中表达人NDRG2基因的截短部分并进行鉴定。方法:以含有人NDRG2基因的pGKBT7质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得截短的人NDRG2基因,然后克隆入表达载体pEGFP-C2;以荧光显微镜观察和WesternBlotting方法对表达... 目的:在pEGFP-C2真核表达载体中表达人NDRG2基因的截短部分并进行鉴定。方法:以含有人NDRG2基因的pGKBT7质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得截短的人NDRG2基因,然后克隆入表达载体pEGFP-C2;以荧光显微镜观察和WesternBlotting方法对表达产物进行鉴定。结果:表达产物中在分子量67kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被Ndrg2单克隆抗体特异性识别。结论:构建了截短的人NDRG2基因真核表达载体,并在真核细胞中(HEK-293)获得成功表达。 展开更多
关键词 nDRG2 基因 PCR 真核表达载体pegfp-C2
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重组质粒pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响 被引量：3
6
作者 尉春艳 张熙 +3 位作者 孙学军 彭慧霞 贺赛 王桂贤 《山西医科大学学报》 CAS 2014年第8期695-698,784,785,共6页
目的评估重组质粒pEGFP-N1-Twist对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用real-time PCR和Western blot检测Twist基因与蛋白的表达情况;通过Transwell及MTT试验检测pEGFP-N1-Twist对SK... 目的评估重组质粒pEGFP-N1-Twist对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用real-time PCR和Western blot检测Twist基因与蛋白的表达情况;通过Transwell及MTT试验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果转染了pEGFP-N1-Twist的SKOV3细胞中Twist基因/蛋白的表达明显上调;转染组较空白对照组侵袭及迁移能力增强(P<0.05),细胞增殖能力明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的侵袭及迁移能力、细胞增殖能力。 展开更多
关键词 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pegfp-n1 基因克隆
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重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响 被引量：1
7
作者 尉春艳 张熙 +3 位作者 孙学军 彭慧霞 史玉霞 王桂贤 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期447-450,共4页
目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western b... 目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。 展开更多
关键词 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pegfp-n1 基因克隆
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pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定 被引量：1
8
作者 王健 王晓东 +1 位作者 唐冠杰 赵佳 《中国普外基础与临床杂志》 CAS 2014年第3期300-304,共5页
目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电... 目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法转染Top10感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染)。采用Western blot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708 bp处和4 700 bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Western blot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5,空白对照组为0.301 7±0.028 7,未转染组为0.314 3±0.026 6,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 组织因子途径抑制物-2 pegfp-n3真核载体 双酶切反应 序列分析 WESTERn BLOT法
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重组质粒pEGFP-C1-LRIG1的构建及其在SHG44细胞中的稳定表达
9
作者 方园 屈建强 +3 位作者 张熙 周乐 孙梦瑶 娄淼 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期541-544,共4页
目的构建含目的基因多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1)的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1,为胶质瘤等多种上皮源性肿瘤的分子治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法,从人全血总RNA中,扩增出3 282bp的LRIG1cDNA片段,再用XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后,定... 目的构建含目的基因多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1)的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1,为胶质瘤等多种上皮源性肿瘤的分子治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法,从人全血总RNA中,扩增出3 282bp的LRIG1cDNA片段,再用XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后,定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;免疫细胞化学法检测LRIG1基因的表达情况。结果人LRIG1基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1质粒中;经脂质体转染SHG44细胞后,G418进行筛选,可见转染细胞胞膜上有大量LRIG1蛋白表达。结论成功构建了pEGFP-C1-LRIG1的真核表达载体,为研究LRIG1基因在胶质瘤等多种上皮源性肿瘤中的作用和其治疗奠定一定的实验基础。 展开更多
关键词 基因克隆 真核表达载体pegfp-C1 重组质粒 胶质瘤 多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1基因)
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