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pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体的构建和鉴定 被引量：1
1
作者 王健 王晓东 +1 位作者 唐冠杰 赵佳 《中国普外基础与临床杂志》 CAS 2014年第3期300-304,共5页
目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电... 目的构建pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为研究TFPI-2基因的功能做准备。方法从胎盘组织中提取总RNA,逆转录合成cDNA,再以PCR法进行扩增。将扩增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表达载体上,经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,同时测定其DNA序列。将pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体以脂质体LipofectamineTM 2000介导的方法转染Top10感受态细胞(转染组),同时设空白对照组(仅转染pEGFP-N3质粒)和未转染组(不予转染)。采用Western blot法检测3组细胞中TFPI-2蛋白的表达情况。结果总RNA经分光光度法验证,其纯度符合PCR法扩增的要求。构建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后,行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,分别在708 bp处和4 700 bp处有特异扩增条带,大小与理论值一致。DNA序列测定结果证实,pEFFP-N3-TFPI-2真核表达载体的序列完全正确。Western blot法结果显示,TFPI-2蛋白的表达量转染组为0.657 3±0.032 5,空白对照组为0.301 7±0.028 7,未转染组为0.314 3±0.026 6,转染组TFPI-2蛋白的表达量高于空白对照组和未转染组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验成功构建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表达载体,为TFPI-2基因功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 组织因子途径抑制物-2 pegfp-n3真核载体 双酶切反应 序列分析 WESTERn BLOT法
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人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达 被引量：2
2
作者 钱进军 程言博 +2 位作者 刘春风 杨亚萍 刘康永 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期23-26,共4页
目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序... 目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synu-clein(SNCA)的单克隆PC12细胞株。方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序。在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR I、BamHI两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定。以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株。结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功。RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达。结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53Tα-synuclein的单克隆PC12细胞株。 展开更多
关键词 α-synuclein(SnCA) 致病突变 真核表达载体pegfp-C3 稳定转染 PC12细胞
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pEGFP—N1-hPer2载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达 被引量：1
3
作者 程安源 郭卫春 +3 位作者 戢鹏 方硕 杨俭 余铃 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期737-740,共4页
目的构建人的生物钟基因Period2（hPer2）真核表达载体pEGFP-N1-hPer2，观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达。方法应用实时定量荧光反转录聚合酶链反应（FQ—PCR）技术从MG63细胞中扩增hPer2，并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP—N1的... 目的构建人的生物钟基因Period2（hPer2）真核表达载体pEGFP-N1-hPer2，观察其在骨肉瘤细胞MG63中的表达。方法应用实时定量荧光反转录聚合酶链反应（FQ—PCR）技术从MG63细胞中扩增hPer2，并将PCR产物经双酶切后定向克隆入pEGFP—N1的多克隆位点，采用脂质体介导转染骨肉瘤细胞MC63，采用FQ-PCR和Westernblot分别检测hPer2的表达。结果重组质粒经PstI、KpnI双酶切和测序与hPer2基因序列一致，利用脂质体介导将pEGFP—N1-hPer2重组质粒成功转染到骨肉瘤细胞MG63中并获得了hPer2基因的过表达。FQ-PCR显示实验组（pEGFP—N1-hPer2组）的mRNA水平（7．84±1．17）明显高于空载体组（pEGFP—N1组，1．42±2．11）和空白对照组（1．21±1．61）；Westemblot显示实验组hPer2蛋白（0．382±1．131）的表达明显高于空载体组（0．178±2．110）和空白对照组（0．166±1．951），差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论成功构建pEGFP—N1-hPer2真核表达载体，并能够在骨肉瘤细胞MG63中过表达。 展开更多
关键词 生物节律 人生物钟基因Period2 骨肉瘤 MG63 真核表达载体pegfp—n1
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大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建 被引量：1
4
作者 张建红 刘艳霞 +2 位作者 王宝利 范海鸣 吴艳娜 《天津医科大学学报》 2007年第4期479-481,488,共4页
目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序... 目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 寡霉素敏感相关蛋白 克隆 pegfp—n1真核表达载体 大鼠
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