pcDNA3.1表达载体转染对细胞生长的影响 被引量：1

1

作者 余鹰 周鸣 +3 位作者 曹利 唐珂 李伟芳 李桂源 《生物技术》 CAS CSCD 2001年第1期1-3,共3页

为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响，通过脂质体介导将ｐｃＤＮＡ３．１（＋）表达载体ＤＮＡ转染鼻咽癌细胞系 ＨＮＥ１，Ｇ４１８筛选后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定稳定表达细胞株，以 ＨＮＥ１细胞为对照，观察ｐｃＮＡ３．... 为了探讨真核表达载体转染对细胞生长的影响，通过脂质体介导将ｐｃＤＮＡ３．１（＋）表达载体ＤＮＡ转染鼻咽癌细胞系 ＨＮＥ１，Ｇ４１８筛选后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定稳定表达细胞株，以 ＨＮＥ１细胞为对照，观察ｐｃＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１克隆细胞的生物学特性；结果显示，在ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＨＮＥ１阳性克隆中，一株细胞克隆培养过程中发生自溶性死亡，一株细胞生长明显受到抑制，另一株细胞生长无明显影响，揭示在宿主细胞中ｐｃＤＮＡ３.１（＋）ＤＮＡ与宿主基因组ＤＮＡ发生了随机整合，从而表现不同的细胞生物学改变。 展开更多

关键词 真核表达系统 PCDNA3.1(+)载体 整合 哺乳动物细胞

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人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建 被引量：3

2

作者 李晓永 冯绮文 +4 位作者 董艳 周亚芹 葛勤敏 张洪梅 苏青 《新乡医学院学报》 CAS 2008年第1期1-4,共4页

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真... 目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。 展开更多

关键词 甲状腺刺激激素受体 克隆 真核表达载体

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血吸虫硫氧还蛋白免疫原性研究 Ⅰ日本血吸虫硫氧还蛋白DNA疫苗的构建和鉴定 被引量：3

3

作者 曹建平 韩海勃 刘述先 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2005年第4期250-254,共5页

目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TC... 目的构建日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白(Trx)DNA疫苗(pcDNA3-SjcTrx),并进行分子生物学鉴定。方法根据日本血吸虫菲律宾株Trx基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入EcoRI酶切位点和终止密码子TCA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株Trx(SjcTrx)编码基因。经双酶切并纯化的PCR产物与经双酶切纯化的pcDNA3质粒DNA片段用T4DNA连接酶连接,克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3-SjcTrx,并经限制性内切酶双酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR检测和核苷酸序列测定进行鉴定。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334bp,构建的pcDNA3-SjcTrx重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段,根据核苷酸序列测定结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。结论日本血吸虫(大陆株)硫氧还蛋白DNA疫苗构建成功,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。 展开更多

关键词 日本血吸虫 硫氧还蛋白 真核表达载体 核酸疫苗 小鼠 免疫

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重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达 被引量：2

4

作者 程岚 束蓉 +1 位作者 张秀丽 田聆 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1108-1112,共5页

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的... 目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。 展开更多

关键词 重组人釉原蛋白 真核表达载体 转染 稳定表达

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人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 被引量：2

5

作者 左广锋 陈绍良 +1 位作者 徐艳 肖杭 《现代生物医学进展》 CAS 2011年第6期1068-1071,共4页

目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染... 目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果:测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论:成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。 展开更多

关键词 HCN4基因 真核表达载体 转染 异源性表达

原文传递

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

6

作者 孙玉英 奚永志 +3 位作者 王丽英 崔建武 刘楠 梁飞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1090-1092,1095,共4页

目的　克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA ,并构建其真核表达载体 ,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法　从KG 1a细胞提取总RNA ,RT PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定 ,构建其真核表达载体pcD NA3 1 C... 目的　克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA ,并构建其真核表达载体 ,探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法　从KG 1a细胞提取总RNA ,RT PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定 ,构建其真核表达载体pcD NA3 1 CD34。选取 4～ 6周龄的BALB/c小鼠 12只 ,随机分为 3组 ,预先在股四头肌注射 2 5 %的蔗糖溶液 5 0 μl,然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3 1以及PBS稀释的pcDNA3 1 CD34,每 2周 1次共 3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果　所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长 886bp ,扩增片段大小与理论值相符 ,测序结果与文献报道完全一致 ,并且在 5′端引入HindⅢ酶切位点 ,3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体 pCD NA3 1中 ,称之为pcDNA3 1 CD34,经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实 pcDNA3 1 CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明 ,用pcDNA3 1 CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅 1/ 4只在免疫结束后的第 2～ 6周有较低滴度的CD34抗体产生 ,其余 3只血清中均未检测到CD34抗体。结论　成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体 pcDNA3 1 CD34。 展开更多

关键词 抗原 CD34 造血干/祖细胞 抗体 单克隆 真核表达载体 基因免疫

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人PCK1基因克隆及其表达载体的构建 被引量：1

7

作者 董艳 张宏利 +2 位作者 冯绮文 陈雪茹 苏青 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期135-137,共3页

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并... 目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。 展开更多

关键词 PCK1基因 克隆 真核表达载体 构建

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日本血吸虫Dna J-类似蛋白基因真核表达载体的构建与鉴定 被引量：1

8

作者 黄家芳 肖建华 +2 位作者 曾桥 胡永轩 万志刚 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 2005年第2期107-110,共4页

目的　构建日本血吸虫Dna J-类似蛋白真核表达载体,以待进行动物实验观察其保护性免疫作用。方法　在已构建的克隆载体p Bluescript SK+ / Sj Dna J-类似蛋白(保存于日本血吸虫成虫c DNA文库中)的基础上,根据Dna J-类似蛋白基因序列设... 目的　构建日本血吸虫Dna J-类似蛋白真核表达载体,以待进行动物实验观察其保护性免疫作用。方法　在已构建的克隆载体p Bluescript SK+ / Sj Dna J-类似蛋白(保存于日本血吸虫成虫c DNA文库中)的基础上,根据Dna J-类似蛋白基因序列设计一对引物,PCR扩增后与T载体连接,T/ A克隆筛选后经Eco R 和Xba 双酶切,连接入真核表达载体pc DNA3.1(+) ,构建重组质粒并转化入DH5α,再进行重组基因鉴定。结果　此重组体转入了完整的日本血吸虫Dna J-类似蛋白基因。结论　构建了日本血吸虫Dna J-类似蛋白真核表达载体。 展开更多

关键词 日本血吸虫 DNA J-类似蛋白 真核表达载体 核酸疫苗

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凋亡素基因序列重组及其真核表达载体的构建

9

作者 朱惠明 杨俊文 +2 位作者 王娜 蔡筱彦 邓传珍 《现代消化及介入诊疗》 2004年第3期143-145,183,共4页

目的构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体,为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋... 目的构建携带Kozak序列的重组凋亡素基因VP3表达载体,为提高凋亡素基因在肿瘤细胞中的表达效率,增强其诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性奠定实验基础。方法通过两次PCR,以pcDNA-VP3质粒为模板,扩增出带Kozak序列(真核核糖体结合位点)的凋亡素基因VP3。将其克隆到真核表达载体pRevTRE的多克隆位点,构建重组凋亡素的真核表达载体pRevTRE-VP3,将该重组表达载体分别以限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切鉴定,进一步将初步鉴定显示插入目的基因的质粒进行测序鉴定。结果测序结果表明,本研究合成的凋亡素基因与Noteborn报告的凋亡素基因序列一致,同源性为100%。在其起始密码子前添加了Kozak序列的凋亡素基因已成功克隆到真核表达载体pRevTRE。结论采用两次PCR法可将提高表达效率的真核核糖体结合位点添加到凋亡素基因序列起始密码子前端,并构建成凋亡素真核表达载体。 展开更多

关键词 凋亡素 真核表达载体 基因序列 核糖体 质粒 肿瘤细胞凋亡 测序 携带 结合位点 高表达

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重组真核表达载体pcDNA3.1-Annexin A2的构建与鉴定

10

作者 何火聪 苏颖 +2 位作者 林可焴 邹长棪 陈超 《海峡药学》 2015年第9期231-232,共2页

目的构建含Annexin A2目的基因的重组表达质粒。方法从鼻咽癌CNE-2细胞提取总RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后与pc DNA3.1(+)真核表达载体连接,构建真核表达载体pc DNA3.1-Annexin A2,转化DH5α,筛选阳性重组子,抽... 目的构建含Annexin A2目的基因的重组表达质粒。方法从鼻咽癌CNE-2细胞提取总RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后与pc DNA3.1(+)真核表达载体连接,构建真核表达载体pc DNA3.1-Annexin A2,转化DH5α,筛选阳性重组子,抽质粒进行KpnⅠand XbaⅠ双酶切、PCR和测序鉴定。结果重组质粒经PCR和酶切后都获得与RT-PCR大小相同的产物,长度约为1020b P,测序结果与基因库一致。结论成功构建重组真核表达质粒pc DNA3.1-Annexin A2。 展开更多

关键词 ANNEXIN A2 真核表达载体 PC DNA3.1(+)

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甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

11

作者 刘静 许永庆 +3 位作者 王冰 曾胜 戚菲菲 刘北星 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2013年第2期24-27,共4页

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达。提取流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染... 研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达。提取流感病毒Influenza A/FM/1/47(H1N1)RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达。甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 M1基因 真核表达载体 免疫荧光

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流体动力学法表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型的建立

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作者 胡安康 范宝峰 +3 位作者 朱孝荣 汤仁仙 郑葵阳 刘晓梅 《中国比较医学杂志》 CAS 2009年第1期8-10,F0002,共4页

目的建立表达乙肝病毒X蛋白的小鼠模型。方法实验动物分成模型组和对照组,模型组利用已构建的含有HBX基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX,对照组以等量生理盐水代替,采用流体动力学法将质粒经尾静脉高压注入小鼠体内,24h后取小鼠肝组织... 目的建立表达乙肝病毒X蛋白的小鼠模型。方法实验动物分成模型组和对照组,模型组利用已构建的含有HBX基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX,对照组以等量生理盐水代替,采用流体动力学法将质粒经尾静脉高压注入小鼠体内,24h后取小鼠肝组织,行免疫荧光、RT-PCR和Western blot法从不同水平检测HBX在小鼠肝组织内的表达情况。结果模型组小鼠RT-PCR显示肝组织内有HBX mRNA的存在,免疫荧光和Western blot检测均有HBX蛋白的表达;对照组小鼠则无HBX表达。结论成功建立了表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型,为进一步探讨HBX蛋白在动物体内的生物学作用提供实验基础。 展开更多

关键词 流体动力学法 真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX 小鼠 肝组织

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单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

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作者 王琳 郭永章 +3 位作者 李立 张小文 李晓 崔江云 《中国普外基础与临床杂志》 CAS 2002年第4期246-248,共3页

目的　对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法　从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸... 目的　对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法　从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸苷激酶 (TK )基因 ,将扩增的片段克隆入载体 pcDNA3 中 ,挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切 pcDNA3 /HSV ⅡTK ,得到目的基因TK ,将其克隆于已构建的真核表达载体 pcDNA3 /As上。结果　HSV Ⅱ TK基因全部编码区为 112 8bp ,基因序列与 genebank中报道相符。新质粒 pcDNA3 /HSV ⅡTK/As经限制性核酸内切酶 (BamHⅠ ,HindⅢ )酶切后得到 70 0bp(As)及 10 0 0bp(HSV ⅡTK)相应基因片段。 结论　本研究成功构建 pcDNA3 /HSV ⅡTK /As真核表达质粒。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒Ⅱ型 胸苷激酶基因 血管抑制因子 克隆 真核表达载体 融合基因 肿瘤 基因治疗

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