miR-320b靶基因预测与鉴定 被引量：1

1

作者 邸亚男 马思思 +3 位作者 胡涵帅 李卫卫 张珍珠 王晋星一 《中国糖尿病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期12-16,共5页

目的寻找miR-320b靶基因,探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关... 目的寻找miR-320b靶基因,探讨其参与T2DM发生发展的分子机制。方法4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因。采用在线软件VENNY2.1选取4种预测结果交集。在线数据库String查询靶基因编码蛋白质间的相关性,筛选其候选靶基因。采取全基因合成方式合成野生型及突变型靶基因双荧光素酶重组Psicheck-2质粒载体,Sanger测序鉴定重组质粒是否构建成功。选取对数生长期293T细胞分为6组:野生型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-WT+NC)和野生型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-WT+mimic);突变型质粒+miRNA阴性对照组(Psicheck2-PTEN-Mut+NC)和突变型质粒+miR-320b mimic组(Psicheck2-PTEN-Mut+mimic);空质粒载体+miRNA阴性对照组(Psicheck2-NC+NC)和空质粒载体+miR-320b mimic组(Psicheck2-NC+mimic)。各组进行相应质粒和miRNAs共转染,检测双荧光素酶活性。结果4种在线软件Target Scan、MIRDB、DIANA TOOLS和miRmap预测miR-320b靶基因数分别为847、1045、806和6208,VENNY2.1取交集后得到66个共同靶基因。在线数据库String显示,66个靶蛋白之间的相关性主要集中在以人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)为核心的蛋白。双荧光素酶报告基因实验显示,Psicheck2-PTEN-WT+miR320b组荧光素酶活性比值低于Psicheck2-PTEN-WT+NC组(P<0.05)。结论miR-320b作用于靶基因PTEN的3’UTR,为探讨miR-320b参与T2DM发生发展提供依据。 展开更多

关键词 miR-320b 双荧光素酶报告基因实验 靶基因

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小鼠Trim30α人同源基因的生物信息学筛选及初步鉴定 被引量：1

2

作者 孙大康 安新业 +3 位作者 徐殿红 赵延婷 王健 阮月芹 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2011年第5期397-402,共6页

目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸... 目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.构建Trim22的真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测Trim22对TAB2诱导的NF- κB报告基因活化的影响.结果 Trim30α与人Trim5α.、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点；Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％；Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化,而Trim5α无显著抑制作用.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能. 展开更多

关键词 三基序蛋白22 核因子ΚB 生物信息学 双萤光素酶报告基因系统

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基于荧光素酶双报告基因系统体外验证长爪沙鼠Cip4基因受RXR及T4调控

3

作者 王志远 刘月环 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2019年第11期78-84,共7页

目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-... 目的 探讨核转录因子TRB、RXR和激动剂T4对长爪沙鼠Cip4基因表达的调控作用。方法 合成长爪沙鼠Cip4基因启动子区序列,构建报告载体p GL3-Cip4;将转录因子TRB、RXR克隆到pc DNA3. 1表达载体上。将p GL3-Cip4,pc DNA3. 1-TRB,pc DNA3. 1-RXR和pRL-TK(参照质粒)载体共转染到HEK-293细胞,构建Cip4基因的荧光素酶双报告系统。观察质粒用量、TRB的激动剂甲状腺素T4等处理对转录活性的影响。结果 以长爪沙鼠Cip4启动子区为启动序列的双荧光素酶报告基因系统在(启动子+转录因子):pRL-TK=20∶1、总质粒量为2μg时转染效率最高,并具有最高的荧光素酶活性。检测结果显示,仅加入TRB不改变Cip4的转录水平(P>0. 05),仅加入RXR可以增加Cip4的转录水平(P<0. 05),RXR与T4共同作用可上调Cip4的转录水平(P<0. 001)。TRB与T4共同作用可下调Cip4活性(P<0. 05)。RXR、TRB、T4共存时,Cip4的转录水平显著下调(P<0. 01)。结论本研究证实了T4、TRB及RXR共调控长爪沙鼠Cip4基因的转录,模拟了配体激活型转录因子TRB/RXR活化目的基因Cip4的转录,同时证实了Cip4的转录活化与RXR信号通路密切相关,为揭示甲状腺素在人类NAFLD中的作用机制奠定了基础。本报告基因系统可用于配体激活型转录因子调控Cip4基因表达的机理分析及相关药物的筛选。 展开更多

关键词 非酒精性脂肪性肝病模型 长爪沙鼠 Cip4基因 荧光素酶双报告基因系统 维甲酸X受体(RXR) 甲状腺素受体B(TRB)

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靶向调控c-SKI的microRNA的筛选及验证

4

作者 王娟 李鹏 +2 位作者 吕忠英 张颖 曹桂秋 《基础医学与临床》 CSCD 2020年第1期60-66,共7页

目的筛选和验证靶向调控c-SKI并与纤维化相关的microRNA(miRNA)。方法生物信息学方法预测并结合文献报道,筛选出靶向c-SKI的候选miRNAs,RT-qPCR检测人心肌成纤维细胞(HCFBs)中候选miRNAs和c-SKI的表达,筛选出抑制作用最显著的miRNA;构建... 目的筛选和验证靶向调控c-SKI并与纤维化相关的microRNA(miRNA)。方法生物信息学方法预测并结合文献报道,筛选出靶向c-SKI的候选miRNAs,RT-qPCR检测人心肌成纤维细胞(HCFBs)中候选miRNAs和c-SKI的表达,筛选出抑制作用最显著的miRNA;构建c-SKI-3′-UTR野生型(c-SKI-wt)和突变型(c-SKI-mut)载体,分别与miR-155a-5p/miR-17a-5p的模拟物、抑制剂及对照在人胚肾上皮细胞(HEK293T)中共转染,双萤光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性;接着,分别将miR-155a/miR-17a-5p mimics和inhibitor转染至人心肌成纤维细胞(HCFBs),Western blot检测各组细胞c-SKI的表达。结果 1)经筛选miR-155a-5p和miR-17a-5p对c-SKI的抑制作用最明显(P<0.01);2)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组萤光素酶活性均显著下降(P<0.05),miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组萤光素酶活性均明显增强(P<0.05);3)与NC组相比,miR-155a-5p/miR-17a-5p mimics组中c-SKI蛋白表达显著下调,miR-155a-5p/miR-17a-5p inhibitor组中c-SKI的表达显著上调(P<0.01)。结论 miR-155a-5p和miR-17a-5p可分别靶向结合c-SKI的3′-UTR,在HCFBs中负性调控c-SKI的表达。 展开更多

关键词 c-SKI miR-155a-5p miR-17a-5p 双萤光素酶报告系统 心肌纤维化

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2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)诱导孕烷X受体(PXR)活化能力的探讨 被引量：2

5

作者 胡辛楠 张建清 +5 位作者 田亚楠 雷毅雄 方道奎 黄海燕 蒋友胜 周健 《毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期10-15,共6页

目的探讨2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)是否为孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)的诱导剂及其诱导PXR受体下游基因细胞色素P4503A4(CYP3A4)的转录表达能力。方法采用CCK-8法测定分析BDE-47对人肝肿瘤细胞株HepG2的细胞毒性作用,并以... 目的探讨2,2′,4,4′-四溴联苯醚(BDE-47)是否为孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)的诱导剂及其诱导PXR受体下游基因细胞色素P4503A4(CYP3A4)的转录表达能力。方法采用CCK-8法测定分析BDE-47对人肝肿瘤细胞株HepG2的细胞毒性作用,并以BDE-47分别处理双萤光素酶hPXR报告基因系统和稳定高表达hPXR的HepG2细胞株,观察其对CYP3A4的诱导作用和对其mRNA及蛋白表达的诱导作用。结果BDE-47对HepG2细胞有明显的细胞毒性作用,且在6～48h呈明显剂量-时间-效应关系(P<0.01)。48h为毒作用兴奋点,其半数抑制浓度(IC50)为110μmol/L。BDE-47能诱导CYP3A4表达量的增高,呈明显剂量-时间-效应关系(P<0.01)。Q-PCR和Western Blot分析发现,其对CYP3A4的mRNA转录和蛋白表达有显著诱导作用,并呈剂量-效应关系(P<0.01),对PXR受体诱导能力明显高于已知的阳性诱导物利福平。结论在本试验条件下,BDE-47是PXR受体的强力诱导剂,可能通过激活PXR受体而发挥其一系列毒性作用。 展开更多

关键词 2 2′ 4 4′-四溴联苯醚(BDE-47) PXR受体 CYP3A4 hPXR双萤光素酶报告基因

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一种适于家蚕细胞激素研究的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒的构建(英文) 被引量：3

6

作者 刘红玲 林英 +6 位作者 沈关望 顾健健 张海燕 吴金鑫 徐银莹 龙威 夏庆友 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1631-1641,共11页

双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒... 双荧光素酶报告基因系统能够提供灵敏的读数,但该系统需要依赖组成型表达的内参对读数进行归一化。然而,大多数内参并不是在所有条件下都组成型表达。为此,文中建立了一个有效的方法制备适于家蚕细胞双荧光素酶报告基因系统的内参质粒。首先,突变BmV gP78启动子上的激素应答相关元件,获得了在家蚕细胞中稳定表达的组成型启动子BmV gP78M;然后,用BmV gP78M替换pRL-SV40质粒上的SV40启动子和嵌合内含子序列,成功构建了pRL-V gP78M内参质粒;最后,通过细胞转染实验证实pRL-V gP78M内参在家蚕细胞系中稳定表达,并且pRL-V gP78M内参的表达活性不受蜕皮激素、保幼激素及激素相关转录因子的影响。最终,获得了在家蚕细胞中稳定表达且表达量适中的内参质粒pRL-V gP78M。该内参可以有效地作为双荧光素酶报告基因系统的内参质粒用于家蚕细胞系中激素的研究。同时,该内参质粒的构建方法也为构建适于其他物种细胞系的双荧光素酶报告基因系统的内参质粒提供了参考。 展开更多

关键词 家蚕 双荧光素酶报告基因系统 内参质粒 激素 方法

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Bmo-miR-2771对家蚕丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用 被引量：1

7

作者 钱平 蒋涛 +5 位作者 王欣 宋菲 陈晨 范洋洋 唐顺明 沈兴家 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期826-831,共6页

微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库... 微小RNA(miRNA)可通过抑制mRNA转录或使RNA降解的方式在转录后水平调节靶基因的表达。研究与家蚕丝胶蛋白基因1(BmS er-1)转录后表达有关的miRNA(Bmo-miR)及其作用方式,以丰富丝胶蛋白基因表达的精细调控信息。首先从miRBase 21数据库中获得全部成熟体Bmo-miR,通过生物信息学分析筛选到一个对BmS er-1有潜在调控作用的BmomiR,命名为Bmo-miR-2771。设计茎环引物,采用半定量RT-PCR方法检测Bmo-miR-2771及其预测靶基因BmS er-1在家蚕5龄3 d幼虫头部、脂肪体、前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺、中肠等组织器官以及血淋巴细胞中的表达水平,结果显示Bmo-miR-2771特异性地在中部丝腺中表达,并且靶基因BmS er-1在中部丝腺的相对表达量也明显高于其他组织。将构建的表达BmomiR-2771的重组质粒pcD NA3.0(ie1-egfp-pri-miR-2771-SV40)和表达BmS er-1 3'-UTR的重组质粒pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTRSV40)共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,并以共转染pcD NA3.0(ie1-egfp-SV40)和pG L3(A3-luc-Ser-1 3'UTR-SV40)的BmN细胞为阳性对照,以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参,检测荧光素酶活性,结果显示实验组的荧光素酶活性相对于阳性对照组显著降低(P<0.05),从细胞水平证实了Bmo-miR-2771对BmS er-1基因表达具有负调控作用。 展开更多

关键词 家蚕 丝胶蛋白基因Ser-1 微小RNA Bmo-miR-2771 转录后调控 半定量RT-PCR 双荧光素酶报告基因系统

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PDPK13′UTR双荧光素酶报告载体的构建及与gga-miR-148a-5p的靶向验证 被引量：1

8

作者 余河玲 朱师良 +1 位作者 何启牮 王彦 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第1期147-151,共5页

本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因... 本试验通过构建PDPK1基因3′UTR双荧光素酶报告载体,并验证gga-miR-148a-5p与PDPK1的靶向关系。利用生物信息学软件预测gga-miR-148a-5p与PDPK1结合位点;利用PCR扩增PDPK1基因3′UTR序列,将其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS双荧光素酶报告基因载体中;将gga-miR-148a-5p及阴性对照分别与野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR双荧光素酶报告质粒共转染至293T细胞中,双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。Targetscan、miRbase数据库预测结果显示,gga-miR-148a-5p与PDPK1基因3′UTR存在互补结合位点;酶切及测序结果表明,双荧光素酶报告载体构建成功;荧光素酶活性试验结果表明,gga-miR-148a-5p mimics能够与PDPK1基因3′UTR结合并抑制荧光素酶活性。gga-miR-148a-5p能够与PDPK1靶向性结合,PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。 展开更多

关键词 PDPK1 gga-miR-148a-5p 禽白血病 双荧光素酶报告基因检测系统

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miRNA-570调控ATP合成酶G亚基的表达促进血小板凋亡

9

作者 盖厦 李晓华 +6 位作者 徐慧聪 叶辉 谯铭铭 姬艳博 于媛 陈元锋 庄云龙 《中国输血杂志》 CAS 2020年第3期205-212,共8页

目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 ... 目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 bp),通过在序列两端增加限制酶酶切位点,与双荧光素酶报告基因载体(psiCHECKTM-2)质粒连接,分别构建含有ATP5L 3′UTR的WT和MT的双荧光素酶报告基因载体。依据miRNA数据库中MI0003577人的序列分别合成miRNA-570序列和其阴性序列,分别与构建的双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞,依据转染物的不同将实验分为6组,实验组1:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;实验组2:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;阴性对照组1:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;阴性对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;空白对照组1:miRNA-570序列和psiCHECK-2质粒;空白对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-2质粒。转染48 h后利用生物发光检测仪检测转染细胞的相对荧光强度。收集单采血小板60 mL,利用脂质体方法转染血小板,依据转染物的不同,将实验分为4组,实验组A:miRNA-570序列;阴性对照组B:miRNA-570阴性对照序列;空白对照组C:脂质体2000;空白对照组D:空白(无转染物);分别转染转染血小板,24 h后收集血小板,流式细胞仪检测血小板膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻表达,Western blot检测血小板半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达,ELISA方法检测血小板Caspase-3活性。结果分别成功构建了psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT和-MT的双荧光素酶报告基因质粒载体。转染293T细胞测定的相对荧光强度:实验组1、实验组2、阴性对照组1、阴性对照组2、空白对照组1、空白对照组2分别为0.673±0.080、0.967±0.059、0.97±0.076、0.96±0.075、0.97±0.067、1.0±0.1(P<0.05)。实验组A、阴性对照序列组B、空白对� 展开更多

关键词 微小RNA(miRNA)-570 血小板凋亡 ATP合成酶G亚基基因 磷脂酰丝氨酸 半胱氨酸蛋白酶-3 双荧光素酶报告基因系统

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miRNA-326作用于其靶基因BCL-XL的研究

10

作者 谯铭铭 盖厦 +5 位作者 叶辉 姬艳博 于媛 陈元锋 徐慧聪 庄云龙 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 2020年第9期987-990,共4页

目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野... 目的研究miRNA-326是否作用于其靶基因BCL-XL,探讨miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法利用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶组成双荧光素酶报告基因实验系统,分别构建含有BCL-XL 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段的野生型和变异型的双荧光素酶载体,设置对照组,转染细胞检测相对荧光强度。结果分别构建了PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT(野生型)和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT(变异型)的双荧光素酶报告基因质粒载体;miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染测定的相对荧光强度显著低于对照组(miRNA-326阴性对照序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-WT质粒共转染组)(P=0.034);同时也显著低于miRNA-326序列和PsiCHECK-BCL-XL-3′UTR-MT质粒共转染的变异组(P=0.022)。结论miRNA-326作用于BCL-XL基因的3′UTR;这为研究miRNA调控血小板凋亡的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 miRNA-326 BCL-XL基因 3′非翻译区 双荧光素酶报告基因系统

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用于细胞水平家蚕转录调控元件研究的简单基础启动子的构建

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作者 顾健健 刘红玲 +7 位作者 李凯荣 孟紫旺 王慧娟 沈关望 张宇靖 阮杨 林英 夏庆友 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期391-397,共7页

【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的... 【目的】本研究致力于构建一种能够在家蚕Bombyx mori细胞水平稳定表达的简单基础启动子,从而更准确地反映单一转录调控元件对基因启动子活性的影响,为研究家蚕乃至其他昆虫的基因转录调控奠定基础。【方法】本研究在本课题组已报道的能在家蚕细胞中稳定表达且基本不含上游转录调控元件的BmVgP78M启动子的基础上,通过PCR技术在其上游添加一定长度的间隔序列和能够应答20-羟基蜕皮激素(20E)且增强启动子活性的BrC-Z2转录因子结合基序(BrC-Z2 element, BrC-Z2E);通过基因克隆技术构建细胞转染载体;通过细胞转染技术和双荧光素酶报告基因系统检测启动子活性的变化。【结果】通过在BmVgP78M启动子上游添加28 bp间隔序列,成功构建了一个简单基础启动子,命名为VgP78ML,并证明其为可用于研究目标转录调控元件的简单基础启动子。经实验验证表明,该简单基础启动子不仅可以在家蚕细胞中稳定表达,且其本身活性不受20E及转录因子BrC-Z2的影响;当该启动子上游连接BrC-Z2E时,可以显著地应答20E及BrC-Z2转录因子,从而调控报告基因的表达。【结论】VgP78ML能够作为简单基础启动子应用于细胞水平对家蚕基因转录调控进行研究。同时,其构建方法也为其他物种构建研究转录调控的简单基础启动子提供了参考。 展开更多

关键词 家蚕 细胞 简单基础启动子 双荧光素酶报告基因系统 转录调控 转录元件

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