To measure Derp1 and Blot5 allergen levels in asthmatics’ homes in Hongkong. Methods Seventy houses were enrolled for a mite indoor environment study. Dust samples were obtained from two sites of each patients’ hous...To measure Derp1 and Blot5 allergen levels in asthmatics’ homes in Hongkong. Methods Seventy houses were enrolled for a mite indoor environment study. Dust samples were obtained from two sites of each patients’ house: bed and floor. Derp1 and Blot5 levels were quantified by a two-site monoclonal antibody-based ELISA technique. Results The levels of Derp1 allergens found in bed (geometric mean (GM) 3.43 μg/g of dust; 95%CI, 1.89-4.96 μg/g) and on the floor (GM 1.12 μg/g of dust; 95%CI, 0.71-1.53 μg/g) indicated significant differences (P = 0.005). However, the levels of Blot5 allergens found in bed (GM 19.00 μg/g of dust; 95%CI, 0.89-38.90 μg/g) and on the floor (GM 6.14 μg/g of dust; 95%CI, 0.40-11.90 μg/g) showed no statistically significant difference. In addition, in regards to the exposure index for Derp1 and Blot5 allergens found in bed and on the floor, 17.6% in bed and 8.6% on the floor had levels of Blot5 ≥ 10 μg/g of dust, higher than those obtained for Derp1 (7.2% and 0% in bed and on the floor respectively, P < 0.05); higher percentages in bed and on the floor (25.0% and 35.7%) were observed for levels of Blot5 = 0 μg/g of dust as compared with Derp1 in bed and on the floor (4.3% and 14.5% respectively, P < 0.05). Conclusions Derp1 and Blot5 are the major allergens found in this regional study, Blot5 is a more potent allergen in Hongkong, probably reflecting the high level of exposure to Blomia tropicalis (Bt). Bt and Dermatophagoides pteronyssinus(Dp) allergens should be included for precise diagnosis and effective immuno-therapeutic treatment of mite allergy in Hong-kong.展开更多
目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将...目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD鄄32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后的片段连接至pET鄄32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基鄄β鄄D鄄硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性。分别采用BLAST、 ProtParam、 PSIPRED、 SWISS鄄MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测。结果RT鄄PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Der p 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸。经IPTG诱导后大量表达Der p 3重组蛋白。该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mr)约30 000。Western blotting分析结果显示,重组蛋白Der p 3能与10份尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合。BLAST和MEGA分析结果显示, Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80%。Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列。结论纯化后的Der p 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性。展开更多
目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋...目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD,Western blotting结果显示有明显条带。结论成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。展开更多
目的原核表达尘螨主要变应原Der p 2。方法分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用I...目的原核表达尘螨主要变应原Der p 2。方法分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET28a(+)-Derp2,SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 2编码基因与参考序列同源性达99.54%,推测其编码氨基酸130个,相对分子质量约为14348.5。结论尘螨变应原Der p 2原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。展开更多
目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定...目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH5α,筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆,培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析;应用Lipo-fectamine 2000脂质体转染剂,重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法,以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Der p 1基因与Genbank上Der p 1cDNA全长序列完全一致,且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致;成功构建含Der p 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1,其能在真核细胞成功表达重组蛋白。展开更多
目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果...目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。展开更多
文摘To measure Derp1 and Blot5 allergen levels in asthmatics’ homes in Hongkong. Methods Seventy houses were enrolled for a mite indoor environment study. Dust samples were obtained from two sites of each patients’ house: bed and floor. Derp1 and Blot5 levels were quantified by a two-site monoclonal antibody-based ELISA technique. Results The levels of Derp1 allergens found in bed (geometric mean (GM) 3.43 μg/g of dust; 95%CI, 1.89-4.96 μg/g) and on the floor (GM 1.12 μg/g of dust; 95%CI, 0.71-1.53 μg/g) indicated significant differences (P = 0.005). However, the levels of Blot5 allergens found in bed (GM 19.00 μg/g of dust; 95%CI, 0.89-38.90 μg/g) and on the floor (GM 6.14 μg/g of dust; 95%CI, 0.40-11.90 μg/g) showed no statistically significant difference. In addition, in regards to the exposure index for Derp1 and Blot5 allergens found in bed and on the floor, 17.6% in bed and 8.6% on the floor had levels of Blot5 ≥ 10 μg/g of dust, higher than those obtained for Derp1 (7.2% and 0% in bed and on the floor respectively, P < 0.05); higher percentages in bed and on the floor (25.0% and 35.7%) were observed for levels of Blot5 = 0 μg/g of dust as compared with Derp1 in bed and on the floor (4.3% and 14.5% respectively, P < 0.05). Conclusions Derp1 and Blot5 are the major allergens found in this regional study, Blot5 is a more potent allergen in Hongkong, probably reflecting the high level of exposure to Blomia tropicalis (Bt). Bt and Dermatophagoides pteronyssinus(Dp) allergens should be included for precise diagnosis and effective immuno-therapeutic treatment of mite allergy in Hong-kong.
文摘目的克隆、表达屋尘螨3类变应原(Der p 3)基因,纯化Der p 3重组蛋白,对其免疫原性及生物信息学特点进行分析。方法取实验室纯培养的屋尘螨500只,提取总RNA,逆转录生成cDNA, RT鄄PCR扩增Der p 3基因。扩增的Der p 3基因经测序正确后,将目的条带连接至pMD鄄32T载体中进行扩增,并利用限制性内切酶Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后的片段连接至pET鄄32a表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中,经1 mmol/L异丙基鄄β鄄D鄄硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,蛋白质印迹(Western boltting)分析重组蛋白的免疫原性。分别采用BLAST、 ProtParam、 PSIPRED、 SWISS鄄MODEL对重组蛋白的同源性、理化性质、二级结构、三级结构进行分析;通过BLAST和MEGA构建Der p 3的系统进化树;并利用IEBD和DNA Star对Der p 3重组蛋白的抗原表位进行预测。结果RT鄄PCR扩增屋尘螨Der p 3基因,得到约1 000 bp的片段,经测序为Der p 3目的序列,其开放阅读框为786 bp,编码261个氨基酸。经IPTG诱导后大量表达Der p 3重组蛋白。该蛋白主要以包涵体形式存在,相对分子质量(Mr)约30 000。Western blotting分析结果显示,重组蛋白Der p 3能与10份尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合。BLAST和MEGA分析结果显示, Der p 3基因与粉尘螨3类变应原(Der f 3)的序列一致性较高,约80%。Der p 3蛋白较稳定,二级结构由螺旋、延伸链、随机线圈组成;并预测到6个抗原表位肽序列。结论纯化后的Der p 3重组蛋白能与尘螨过敏性哮喘患者血清IgE抗体特异性结合,具有较强免疫原性。
文摘目的屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD,Western blotting结果显示有明显条带。结论成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。
文摘目的原核表达尘螨主要变应原Der p 2。方法分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 2核酸序列设计引物用RT-PCR扩增Der p 2编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET28a(+),将表达质粒转化至Escherichia coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET28a(+)-Derp2,SDS-PAGE和Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 2编码基因与参考序列同源性达99.54%,推测其编码氨基酸130个,相对分子质量约为14348.5。结论尘螨变应原Der p 2原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。
文摘目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH5α,筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆,培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析;应用Lipo-fectamine 2000脂质体转染剂,重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法,以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Der p 1基因与Genbank上Der p 1cDNA全长序列完全一致,且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致;成功构建含Der p 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1,其能在真核细胞成功表达重组蛋白。
文摘目的:分析尘螨1类变应原的理化特性。方法:Gen Bank检索尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1的氨基酸序列,利用生物信息学软件预测分析这两个氨基酸序列的一级结构、疏水性、跨膜区、二级结构及空间结构,并对其可能的功能位点进行预测。结果:尘螨1类变应原Der f 1和Der p 1分别编码321和320个氨基酸,分子量分别为36.4和36.1 ku,理论等电点(p1)分别为5.66和5.65,两蛋白均为亲水性蛋白且可能均无跨膜区,Der f 1的二级结构以不规则卷曲为主(43.93%),而Der p1的二级结构以α螺旋为主(43.75%)。两变应原均由蛋白酶抑制子I 29和木瓜蛋白酶C-端2个结构域组成,且半胱氨酸活性位点、组氨酸活性位点和天冬酰胺活性位点的位置相似。结论:Der f 1和Der p 1的这些特性有助于为螨性过敏性疾病的变应原特异性免疫治疗提供理论支持。
