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RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建 被引量：2
1
作者 刘永光 刘克锋 孙向阳 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2011年第21期12707-12709,共3页
[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了p... [目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。 展开更多
关键词 NPR1 广谱抗病 载体构建
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骨形态发生蛋白-7真核表达载体的构建及鉴定 被引量：1
2
作者 李慧卿 韩金祥 李腾国 《生物技术通讯》 CAS 2003年第2期113-115,共3页
从转录水平上对原有载体进行改造,以期提高外源蛋白的表达量,为进一步研究改建载体后蛋白表达量奠定基础。将pBI-EGFP载体上的反应元件Pbi-1切下,连在pTet-On载体上PCMV的下游;然后将外源基因BMP-7重组到原有的pBI-EGFP载体内,进行酶切... 从转录水平上对原有载体进行改造,以期提高外源蛋白的表达量,为进一步研究改建载体后蛋白表达量奠定基础。将pBI-EGFP载体上的反应元件Pbi-1切下,连在pTet-On载体上PCMV的下游;然后将外源基因BMP-7重组到原有的pBI-EGFP载体内,进行酶切和序列鉴定。成功地构建了pTet-On-Pbi-1载体和真核表达载体pBI/BMP-7。 展开更多
关键词 骨形态发生蛋白—7 真核表达载体 构建 鉴定 Tet—on表达系统 细胞培养
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一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究 被引量：2
3
作者 张桐 王文亮 +4 位作者 侯云德 杨新科 颜子颖 孙立连 王伯云 《西安医科大学学报》 CSCD 1997年第3期312-316,320,共6页
以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2... 以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 腺伴随病毒 载体构建 基因表达 基因载体
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β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV－2）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达
4
作者 张桐 王文亮 +4 位作者 王伯云 杨新科 颜子颖 段淑敏 候云德 《细胞与分子免疫学杂志》 CSCD 1996年第4期11-16,共6页
以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主... 以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ＰＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））ＬａｃＺ基因表达的动态变化特点是，转染后表达较早（１２～２４ｈ）出现，并迅速达到高峰值（经２４ｈ），随后较快下降（经４８～７２ｈ）并维持在较低水平。将启动子附近ｉｔｒ结构有差别的上述两载体转染宿主细胞７２ｈ后做表达水平比较，结果ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）在２９３细胞和Ａ５４９细胞中，ＬａｃＺ表达水平均高于ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）（１．２倍～１．４倍），提示启动子附近ＡＡＶｉｔｒ结构的变异对表达有一定的影响。 展开更多
关键词 腺伴随病毒 基因治疗 载体 构建 Β-半乳糖苷酶
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绿色荧光蛋白表达载体pXS75-GFP的构建及在嗜热四膜虫中的应用
5
作者 梁海霞 王伟 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1010-1016,共7页
为获得能够用于构建嗜热四膜虫蛋白定位的载体,该研究将GFP基因与镉(Cd2+)诱导的四膜虫金属硫蛋白基因(MTT1)启动子序列和终止子序列融合,获得表达载体pXS75-GFP。通过同源重组和抗性筛选,pXS75-GFP载体携带的目的基因整合入四膜虫MTT1... 为获得能够用于构建嗜热四膜虫蛋白定位的载体,该研究将GFP基因与镉(Cd2+)诱导的四膜虫金属硫蛋白基因(MTT1)启动子序列和终止子序列融合,获得表达载体pXS75-GFP。通过同源重组和抗性筛选,pXS75-GFP载体携带的目的基因整合入四膜虫MTT1位点,在Cd2+诱导下实现GFP融合蛋白的可控表达。将α-tubulin基因ATU1克隆入pXS75-GFP中,重组质粒pXS75-GFP-ATU1通过基因枪转化入四膜虫细胞,在巴龙霉素筛选下获得稳定的α-tubulin-GFP过表达细胞株。激光共聚焦显微镜观察α-tubulin-GFP的定位,结果显示,α-tubulin-GFP融合蛋白在四膜虫细胞中表达并分布于皮层上,表明pXS75-GFP载体可用于嗜热四膜虫功能蛋白的定位分析。 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 载体构建 蛋白定位 嗜热四膜虫
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AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建
6
作者 王天祥 严晓丹 +1 位作者 贾文锁 王华芳 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第21期8943-8945,共3页
[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenB... [目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。 展开更多
关键词 DREB2B 载体构建 基因克隆 不完全酶切
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MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达
7
作者 尚丽平 李武峰 《山西农业科学》 2017年第5期677-679,688,共4页
为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确... 为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10^(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。 展开更多
关键词 CTCF 质粒构建 原核诱导表达
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水稻幼苗特异应答H_2O_2的miRNA169b启动子表达载体的构建
8
作者 徐文 王正明 +1 位作者 刘进元 刘卫群 《生物技术通讯》 CAS 2011年第2期234-237,共4页
目的:研究microRNA169b(miRNA169b)启动子不同长度片段的活性及自身调控。方法:用生物信息学方法分析水稻中miRNA169b前体上游1500 bp序列,并从水稻幼苗基因组DNA中扩增miRNA169b前体上游500、1000和1500 bp启动子片段,分别将3个片段克... 目的:研究microRNA169b(miRNA169b)启动子不同长度片段的活性及自身调控。方法:用生物信息学方法分析水稻中miRNA169b前体上游1500 bp序列,并从水稻幼苗基因组DNA中扩增miRNA169b前体上游500、1000和1500 bp启动子片段,分别将3个片段克隆至萤光素酶报告基因载体p5XGal4-LUC上。结果:构建了miRNA169b启动子重组载体,序列分析表明与预期结果一致。结论:miRNA169b启动子调控的萤光素酶报告基因表达载体的构建,为研究水稻中miRNA基因自身的转录奠定了基础。 展开更多
关键词 水稻 微小RNA 启动子 H2O2 载体构建
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RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建
9
作者 冯亚言 冯慧颖 +4 位作者 徐雷锋 杨盼盼 李雅男 袁素霞 明军 《中国农学通报》 2016年第22期127-132,共6页
为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMo V cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和... 为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMo V cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMo V病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到c DNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的c DNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体p FGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMo V的RNAi植物表达载体p FGC5941-C2和p FGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。 展开更多
关键词 CMV LMoV RNAI 植物表达载体 农杆菌转化
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番茄SlGAMYBL2基因启动子的克隆及表达载体的构建
10
作者 李姗姗 赖馥茜 +2 位作者 蓝春莲 王小敏 莫昭展 《玉林师范学院学报》 2017年第2期70-74,共5页
采用5'端系列缺失分析法,利用PCR方法对Sl GAMYBL2基因上游序列进行特异性扩增,分别克隆1368bp、1127bp、990bp和730bp的启动子片段并构建到p LPlp100载体,经鉴定,构建了4个含Sl GAMYBL2启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载... 采用5'端系列缺失分析法,利用PCR方法对Sl GAMYBL2基因上游序列进行特异性扩增,分别克隆1368bp、1127bp、990bp和730bp的启动子片段并构建到p LPlp100载体,经鉴定,构建了4个含Sl GAMYBL2启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌转化烟草愈伤组织,转化植株经PCR和GUS染色法鉴定,表明构建的表达载体已经转化进烟草植株,为确定Sl GAMYBL2基因上游片段中的顺式作用元件响应非生物胁迫诱导中的作用机理以及后期研究该启动子的组织特异性及诱导表达模式奠定基础. 展开更多
关键词 番茄 启动子 载体构建 顺式作用元件
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sⅡ系列缺失启动子载体的构建
11
作者 石琰璟 黄淑燕 周志芳 《科学技术与工程》 2009年第3期568-571,共4页
为检测新型sⅡ根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段。在启动子片段的5’和3’端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载... 为检测新型sⅡ根部特异启动子的功能,采用PCR的方法,扩增胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因的启动子序列,得到该启动子-650bp和-1000bp区域片段。在启动子片段的5’和3’端分别引入了克隆所需的限制性酶切位点,分别定向克隆到经改造的质粒载体pBI121和pBITM2MARⅡ中,取代原有的组成型启动子CaMV35S,获得了四个含有胡萝卜根部特异启动子sⅡ基因不同缺失片段区域与GUS报告基因的融合检测载体。该系列载体通过农杆菌介导转入胡萝卜,检测sⅡ不同长度片段启动子在胡萝卜根部驱动报告基因的表达情况,分析该启动子的功能。 展开更多
关键词 根部特异启动子 sⅡ启动子 载体构建 农杆菌介导转化
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烟草Ⅰ类几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶cDNA植物双价表达载体的构建及转化番茄的研究 被引量：10
12
作者 李继红 邵寒霜 +2 位作者 郑楷 胡东琼 郑学勤 《热带作物学报》 CSCD 1999年第1期29-33,共5页
将烟草中经修饰的Ⅰ类几了质酶和β－1，3-葡聚糖酶cDNA分别加上CaMV35S启动子和NOS终止子，依次插入到同一植物表达载体pBin19上，获得植物双价表达载体pCG－Ⅱ。然后载体pCG－Ⅱ以土壤农杆菌LBA4404介导转化番茄，再生植株的点杂交及... 将烟草中经修饰的Ⅰ类几了质酶和β－1，3-葡聚糖酶cDNA分别加上CaMV35S启动子和NOS终止子，依次插入到同一植物表达载体pBin19上，获得植物双价表达载体pCG－Ⅱ。然后载体pCG－Ⅱ以土壤农杆菌LBA4404介导转化番茄，再生植株的点杂交及PCR扩增证明两种cDNA已随T－DNA同时导入番茄植株中。 展开更多
关键词 几丁质酶 CDNA β-1 3-葡聚糖酶 CDNA 载体构建
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牡丹PsMADS5基因的克隆、表达及载体构建 被引量：12
13
作者 任磊 王雁 +1 位作者 周琳 彭镇华 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期939-944,共6页
以牡丹品种赵粉(Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen)为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5'非编码区、302bp的3'非编码... 以牡丹品种赵粉(Paeonia suffruticosa L.cv.Zhao Fen)为试材,采用RT-PCR和RACE法从花瓣中获得了1个牡丹SEPALLATA基因cDNA,命名为PsMADS5,GenBank登录号为HQ449569。其cDNA全长1222bp,包含190bp的5'非编码区、302bp的3'非编码区和1个长度为732bp编码243个氨基酸的开放阅读框。序列比对和系统进化分析表明,PsMADS5与葡萄的亲缘关系最近,相似性达83%以上,属于MADS家族SEP亚家族。相对荧光定量PCR分析表明,PsMADS5在花瓣中的表达量最高,其次是心皮,再次是萼片,在雄蕊中表达量最低。成功构建正义和反义表达载体,为牡丹花型改良和品种创新提供基础。 展开更多
关键词 牡丹 基因克隆 表达 载体构建
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转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选 被引量：11
14
作者 王春生 刘欣 +1 位作者 原璐 安铁洙 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1262-1265,共4页
为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采... 为了筛选转pK2.10-拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株,本研究参照GenBank上蜘蛛拖丝蛋白基因序列(AY555585和AH015065)设计并人工合成拟蜘蛛基因四聚体(4S),与pcDNA3.1载体(K2.10启动子)相连构建真核表达载体(pcDNA3.1-K2.10-4S),采用脂质体介导法转染绵羊成纤维细胞,通过药物筛选、阳性细胞鉴定及体外培养等方法,获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因的绵羊成纤维细胞株。结果,用pcDNA3.1-K2.10-4S表达载体转染冷冻复苏的绵羊成纤维细胞后,利用G418筛选法获得neo基因的抗性细胞,即阳性细胞;采用PCR方法对阳性细胞鉴定显示,所构建的载体整合到了细胞基因组中;对阳性细胞的染色体核型分析显示,阳性细胞核型稳定,与正常细胞的核型无差异;阳性细胞经冷冻复苏后仍能保持原有的特性。该细胞株的建立为进一步开展转拟蜘蛛拖丝蛋白基因的克隆羊研究奠定了基础。 展开更多
关键词 拟蜘蛛拖丝蛋白基因 载体构建 转染 绵羊成纤维细胞
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哈萨克族食管癌中cdc42启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体 被引量：8
15
作者 刘玲 张景萍 +6 位作者 李卉 姜孝芳 陈艳 李秀梅 谌宏鸣 赵学信 李惠武 《新疆医科大学学报》 CAS 2010年第7期735-738,共4页
目的构建cdc42基因启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体,研究cdc42基因启动子区的甲基化状态对该基因表达及功能的影响。方法采用PCR方法从新疆哈萨克族食管癌的cDNA表达阳性的标本中扩增出cdc42基因,以阳性组织基因组DNA扩增出cd... 目的构建cdc42基因启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体,研究cdc42基因启动子区的甲基化状态对该基因表达及功能的影响。方法采用PCR方法从新疆哈萨克族食管癌的cDNA表达阳性的标本中扩增出cdc42基因,以阳性组织基因组DNA扩增出cdc42基因启动子区CpG岛,cdc42基因经双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1相连,并转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌E.coliER1793中扩增。经测序成功后,将重组质粒及cdc42基因启动子区CpG岛用HindⅢ酶切,连接后再次转入E.coliER1793中扩增。将重组质粒转染至食管癌细胞株Eca-109中,荧光显微镜观察结果。结果 DNA测序证明获得了包含ORF全长的cdc42基因及其启动子区CpG岛,并将双序列成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中。转染后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白。结论成功构建真核表达载体,为进一步探讨cdc42基因启动子区CpG岛甲基化状态对该基因在哈萨克族食管癌细胞株中的表达及功能的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 CDC42 哈萨克族食管癌 载体构建
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甘肃红豆草BAN基因克隆与双标记选择表达载体构建 被引量：8
16
作者 陈春艳 马晖玲 +4 位作者 董文科 杨江伟 李玉珠 姜寒玉 冯玉兰 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1880-1888,共9页
为探讨编码花青素还原酶BAN基因的功能及其与缩合单宁合成的关系,根据BAN基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术获得甘肃红豆草BAN的相似基因;利用生物信息学相关软件分析,预测其c DNA序列编码的蛋白质结构和功能;采用Real-time PCR法检... 为探讨编码花青素还原酶BAN基因的功能及其与缩合单宁合成的关系,根据BAN基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术获得甘肃红豆草BAN的相似基因;利用生物信息学相关软件分析,预测其c DNA序列编码的蛋白质结构和功能;采用Real-time PCR法检测该基因在甘肃红豆草各组织中的表达;构建含有BAN基因的双标记选择载体。结果表明,克隆的BAN基因与报道的BAN基因序列相似性达到99.41%,其ORF长为1 020 bp,可编码339个氨基酸残基,具有花青素还原酶保守结构域和重要功能位点;三级结构预测显示,预测模型与花青素还原酶单体结构(C2RH8A)相似,属于短链脱氢/还原酶超家族成员,表明其可能具有花青素还原酶的功能。BAN基因在各组织中均表达,其表达量依次为荚果、叶、蕾、花、茎。以此为靶序列,构建携带抗除草剂bar和绿色荧光蛋白GFP基因的双标记选择植物表达载体,将为缩合单宁合成、代谢的进一步研究及抗除草剂和抗臌胀病牧草新品种的培育奠定基础。 展开更多
关键词 甘肃红豆草 基因克隆 表达分析 载体构建
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人端粒酶催化亚单位锤头状核酶诱导肝癌细胞凋亡的作用 被引量：5
17
作者 宋东坡 林菊生 +4 位作者 傅桂莲 孙雪梅 孔心涓 黎培员 马昕 《中华肝脏病杂志》 CAS CSCD 2004年第10期616-619,共4页
目的 构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染入肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况。 方法 用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核... 目的 构建带有U6启动子的人端粒酶催化亚单位锤头状核酶真核表达质粒及其突变体,转染入肝癌细胞株SMMC7721,观察端粒酶活性、细胞增殖和凋亡的情况。 方法 用分子克隆技术构建由U6作为启动子、绿色荧光蛋白基因作为报告基因的核酶真核表达质粒pGTRz-U6及其突变体pGTmRz-U6,并以空质粒pEGFP-C1作为对照。Lipofectamine2000转染人肝癌细胞株SMMC7721,G418筛选阳性克隆。RT-PCR检测核酶及hTERT基因的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)作细胞生长曲线观察其生长情况,TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,流式细胞计数(FCM)法检测细胞的凋亡水平。 结果 核酶、突变核酶在SMMC7721中持续表达;凝胶成像系统分析SMMC7721-pEGFP-C1、SMMC7721-mRz、SMMC7721-Rz hTERT基因表达,用SPSS10.0软件对3种细胞进行分析,发现三者hTERT基因表达水平不同(F=47.987,P<0.01);t检验分析得出SMMC7721-Rz hTERT基因表达明显低于SMMC7721-mRz和SMMC7721- pEGFP-C1(t值分别为-7.640和-11.602,P值均<0.01)。SMMC7721-pEGFP-C1和SMMC7721-mRz hTERT表达没有区别(t=-0.178,P>0.05)。TRAP-银染及FCM结果分别显示,随着细胞的分裂,SMMC7721-Rz和SMMC7721-mRz细胞端粒酶活性逐渐降低,凋亡水平逐渐增加,7PDS细胞凋亡率分别是29.86％和9.87％。 展开更多
关键词 SMMC7721 表达 锤头状核酶 HTERT基因 EGFP 端粒酶催化亚单位 端粒酶活性 启动子 细胞 阳性克隆
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抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测 被引量：5
18
作者 黄帆 徐康 +2 位作者 吴兴刚 马中富 林正 《中国危重病急救医学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第9期531-534,共4页
目的探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72(hHSP72)与组氨酸(His)的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX1TM,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得His hHS... 目的探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72(hHSP72)与组氨酸(His)的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX1TM,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得His hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔,制备抗血清;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测重组抗原的免疫活性。结果重组质粒酶切鉴定结果表明,hHSP72基因已正确插入到pPROEX1TM中,经IPTG诱导后,表达出分子质量约为73ku的蛋白,获得了效价为1∶100000的多克隆抗体。Western blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合,其效价高于市售的单克隆抗体。结论用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达,并能制备得到多克隆抗体;这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。 展开更多
关键词 热休克蛋白72 载体构建 多克隆抗体
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反义LeEIL2基因表达载体的构建及在番茄中的转化 被引量：3
19
作者 薛印革 朱本忠 +2 位作者 薛萍 田慧琴 罗云波 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2003年第10期47-50,共4页
为了研究LeEIL2基因在番茄果实成熟过程中的作用 ,将全长的番茄LeEIL2基因以反义方向构建到植物表达载体 pBI1 2 1上 ,经过酶切鉴定正确后 ,将该载体转入农杆菌EHA1 0 5中 ,通过农杆菌介导法转化番茄 ,经组织培养和抗性筛选获得再生植株... 为了研究LeEIL2基因在番茄果实成熟过程中的作用 ,将全长的番茄LeEIL2基因以反义方向构建到植物表达载体 pBI1 2 1上 ,经过酶切鉴定正确后 ,将该载体转入农杆菌EHA1 0 5中 ,通过农杆菌介导法转化番茄 ,经组织培养和抗性筛选获得再生植株 ,PCR检测再生植株 ,初步鉴定为阳性植株 ,为获得转反义LeEIL2番茄果实打下基础。 展开更多
关键词 LeEIL2基因 番茄 反义表达载体 遗传转化 农杆菌介导 乙烯 EIN3基因
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核蛋白Sam68的原核表达及鉴定 被引量：5
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作者 张华 陈宁 +6 位作者 丁筠 邹德华 潘子夜 李鹏飞 李丽阳 肖丽杰 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2017年第3期73-76,81,共5页
为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sa... 为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中,载体能够在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性,说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。 展开更多
关键词 Sam68 原核表达 载体构建 鉴定
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