无血清悬浮法培养MCF-7细胞系并筛选该细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的初步研究 被引量：14

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作者 许立生 王水 +1 位作者 许健 杜青 《中华肿瘤防治杂志》 CAS 2007年第10期736-740,共5页

目的:研究无血清培养基悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系,筛选并鉴定MCF-7乳腺癌细胞系中的肿瘤干细胞相关亚群。方法:应用乳腺癌培养基在无血清的条件下悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系。通过无血清培养筛选乳腺癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群,将其... 目的:研究无血清培养基悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系,筛选并鉴定MCF-7乳腺癌细胞系中的肿瘤干细胞相关亚群。方法:应用乳腺癌培养基在无血清的条件下悬浮培养MCF-7乳腺癌细胞系。通过无血清培养筛选乳腺癌细胞系肿瘤干细胞相关亚群,将其接种于含血清培养基,观察分化。应用单克隆形成实验、表面标志检测、HOECHST33342染色检测来确定培养出的细胞中肿瘤干细胞的比例及其培养后肿瘤干细胞含量的变化。结果:乳腺癌MCF-7细胞系中有约2.12%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球。细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养的MCF-7无明显差别。流式细胞仪表面标志检测,细胞球中约含83.13%表达CD24-CD44+的细胞,HOECHST33342染色提示细胞球中约含10.06%的侧亚群(sidepopulation)细胞。结论:MCF-7细胞系可在含生长因子的无血清培养基中悬浮生长,并维持细胞系。该细胞系中含有比例较低的具有增殖和分化能力的乳腺癌干细胞相关亚群。表面标志以及HOECHST33342检测差异提示细胞球中仅约1/8细胞具有干细胞的功能。 展开更多

关键词 乳腺肿瘤/病理学 肿瘤干细胞/病理学 细胞系 肿瘤 细胞培养技术/方法

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转化生长因子-β1介导的角膜基质细胞外基质纤维化体外三维培养模型的构建 被引量：4

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作者 靳荷 罗世男 +3 位作者 范梓晰 李杰 周卫为 李霞 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期406-411,共6页

背景 角膜损伤修复过程中细胞外基质（ECM）纤维化是角膜瘢痕形成的基础,转化生长因子-β1（TGF-β1）可引起角膜基质过度产生ECM.我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型,而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建... 背景 角膜损伤修复过程中细胞外基质（ECM）纤维化是角膜瘢痕形成的基础,转化生长因子-β1（TGF-β1）可引起角膜基质过度产生ECM.我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型,而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建角膜基质ECM纤维化的体外三维培养模型有待研究.目的 评估TGF-β1对该三维培养模型中ECM纤维化相关基因表达的影响,确定该三维培养体系是否可以作为角膜基质ECM纤维化的体外三维培养候选模型.方法分离新鲜成年牛角膜,并在基础培养液（DMEM/F12＋体积分数10％胎牛血清）中进行角膜基质细胞的培养,将5＆#215;105个牛角膜基质细胞收集于15 ml离心管中构建体外三维培养模型（Pellet）,根据培养液中添加的TGF-β1质量浓度的不同分为基础培养液组（无TGF-β1）、基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组,于培养2周时用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法（Calcein-AM/PI）法进行细胞活性测定;分别于培养后48 h、1周和2周应用实时荧光定量PCR（real-time PCR）和Western blot法检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（Col Ⅰ）、ColⅢmRNA及其蛋白的表达. 结果 Pellet模型培养后48 h,角膜基质细胞开始抱团,培养后2周经Calcein AM/PI染色证实绝大多数细胞存活.培养后48 h、1周和2周,基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组角膜基质细胞中α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量均明显高于基础培养液组,3个组间的总体差异均有统计学意义（F分组=696.745,P＜0.001;F分组=35.166,P＜0.001;F分组=33.677,P＜0.001）,且随着培养时间的延长,α-SMA、Col Ⅰ和ColⅢmRNA的相对表达量逐渐升高,差异均有统计学意义（F时间=5.863,P＜0.05;F时间=298.614,P＜0.001;F时间=607.472,P＜0.001）;ColⅢmRNA合成速率均大于Col Ⅰ mRNA的合成速率;Western blot检� 展开更多

关键词 角膜基质细胞 创伤修复 细胞培养技术/方法 转化生长因子-Β1 细胞外基质 纤维化 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原

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子宫内膜基质干细胞的分离培养研究 被引量：3

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作者 王利公 杨新园 王伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期311-318,共8页

目的:通过体外分离、培养子宫内膜基质干细胞,观察其生物学特性,探索一种简便、高效的分离培养人子宫内膜基质干细胞的方法。方法:取10例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织标本,磁珠分选及克隆形成实验法分选子宫内膜基质干细胞,... 目的:通过体外分离、培养子宫内膜基质干细胞,观察其生物学特性,探索一种简便、高效的分离培养人子宫内膜基质干细胞的方法。方法:取10例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织标本,磁珠分选及克隆形成实验法分选子宫内膜基质干细胞,传代培养。流式细胞仪检测原代细胞表面标记,MTT法观察基质干细胞体外增殖情况;体外向成骨、成脂诱导分化,茜素红和油红O染色鉴定细胞分化能力,RT-PCR测定骨细胞和脂肪细胞特异性基因表达。同时检测基质干细胞表达胚胎时期标志蛋白OCT-4的情况。结果:通过该方法可获得子宫内膜基质干细胞,细胞易于贴壁,生长良好,传代稳定。细胞CD90和CD105表达阳性而CD45和CD34表达阴性。细胞周期的S期和G2-M期细胞比例高,细胞生长曲线呈"S"形。经成骨及成脂诱导后茜素红和油红O染色分别呈阳性反应,成骨及成脂标志性基因表达阳性。此外,免疫细胞化学染色显示OCT-4表达阳性。结论:子宫内膜基质干细胞具有间充质干细胞特性,来源广、易获取,可作为组织工程种子细胞来源。 展开更多

关键词 子宫内膜 细胞学 干细胞 细胞 培养的 免疫磁化分离 流式细胞术 细胞培养技术 方法

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脂肪干细胞体外快速扩增实验研究 被引量：1

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作者 梁慧 王庆胜 +1 位作者 方海滨 马卉 《中国误诊学杂志》 CAS 2008年第21期5047-5049,共3页

目的:探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增兔脂肪干细胞的方法。方法:比较应用微载体结合旋转生物反应器(RCSS)进行动态培养与平皿静态培养两种方法中,脂肪干细胞生长曲线、倍增时间和生长周期的情况。结果:实验组RCSS法培养... 目的:探索在旋转生物反应器内应用微载体技术快速扩增兔脂肪干细胞的方法。方法:比较应用微载体结合旋转生物反应器(RCSS)进行动态培养与平皿静态培养两种方法中,脂肪干细胞生长曲线、倍增时间和生长周期的情况。结果:实验组RCSS法培养中脂肪干细胞密度可达最初接种的19倍左右,而对照组平皿静态培养仅为6倍余。实验组倍增时间短于对照组,且细胞周期分析显示G2-M期+S期细胞比例高于对照组。结论:利用微载体细胞培养技术可快速地在体外扩增脂肪干细胞。 展开更多

关键词 细胞培养技术/方法 干细胞/细胞学 脂肪组织/细胞学 细胞 培养的

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无动物源性成分培养体系快速诱导人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞的分化 被引量：1

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作者 刘秋慧 王菁 +4 位作者 田蓉 王肖 曹迪 卢晶 罗燕 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期484-488,共5页

背景 随着视网膜色素上皮（RPE）细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）研究的开展,需要优化无动物源性成分（xeno-free）培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞（hESCs）向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建... 背景 随着视网膜色素上皮（RPE）细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）研究的开展,需要优化无动物源性成分（xeno-free）培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞（hESCs）向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要. 目的 建立xeno-free培养体系,优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法. 方法 将hESCs克隆团接种至Vitronectin XFTM,在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1（IGF-1）培养2d,第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml,并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）,第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF,第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021.倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化,免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定,实时荧光定量PCR （qRT-PCR）法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量.结果 分化培养第14天,部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列,且细胞内可见色素颗粒;培养第35天,诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65;培养至第60天,细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形.与诱导分化前比较,诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了（3.43±2.77）倍和（8.91±2.83）倍,而RPE65 mRNA的表达量分别增加了（14.60±3.94）倍和（87.16±9.32）倍,分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65mRNA的相对表达量均明显高于分化前,差异均有统计学意义（均P＜0.05）. 结论 hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞. 展开更多

关键词 胚胎干细胞/药物作用 细胞培养技术/方法 细胞分化 视网膜色素上皮 培养液/药物作用 细胞株 人 无动物源性

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兔视网膜Müller细胞原代培养 被引量：1

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作者 过贵元 胡淑鸾 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期167-169,共3页

目的建立成年兔视网膜Mueler细胞体外原代培养方法。方法运用组织块培养法。分离出成年兔视网膜神经感觉层，剪成1mm×1mm大小组织块，置于含有20％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液／F12培养，采用倒置相差显微镜、透射电子显微... 目的建立成年兔视网膜Mueler细胞体外原代培养方法。方法运用组织块培养法。分离出成年兔视网膜神经感觉层，剪成1mm×1mm大小组织块，置于含有20％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液／F12培养，采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行培养细胞的鉴定。结果培养的细胞块3d后可见部分细胞突起长出，7d后整个组织块周围放射状长出较多细胞。倒置相差显微镜下，培养细胞呈一端细胞体丰富膨大，另一端有一长突起，细胞核椭圆形，常有2个或2个以上核仁；透射电子显微镜下，细胞胞体大，细胞浆丰富，内含丰富的8～10nm的微丝。荧光免疫组织化学法显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白和胞内视黄醛结合蛋白阳性，阳性率达95％以上。结论运用组织块培养法可培养出兔视网膜Mueiler细胞。 展开更多

关键词 细胞培养技术/方法 视网膜/病理生理学 MUELLER细胞

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人重组表皮生长因子和牛磺酸体外诱导人脐血干细胞分化为神经元样细胞

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作者 金玮 邢怡桥 +2 位作者 杨安怀 杨燕宁 艾明 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期261-264,共4页

目的探讨人重组表皮生长因子（rhEGF）和牛磺酸体外诱导人脐血间充质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞的实验条件和可能机制。方法用含有10^5U／L青霉素、100mg／L链霉素、10％胎牛血清（FBS）、5％自体血浆、4mmol／L一谷氨酰胺、30ng... 目的探讨人重组表皮生长因子（rhEGF）和牛磺酸体外诱导人脐血间充质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞的实验条件和可能机制。方法用含有10^5U／L青霉素、100mg／L链霉素、10％胎牛血清（FBS）、5％自体血浆、4mmol／L一谷氨酰胺、30ng／mlrhEGF的Dulbecco改良Eagle培养基与F12以1：1混合（DMEM／F-12）培养液对人脐血MSC进行原代培养，传至第3代后改用含牛磺酸的培养基进行诱导。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD90、CD29、CD34、CD44及CD45的表达。免疫细胞化学方法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、视紫红质、巢蛋白的阳性细胞表达情况。统计学方法采用两组资料的卡方检验分析NSE、视察红质、巢蛋白的表达。结果脐血MSC首次培养5～7d，有间充质样细胞贴壁，3～4周后细胞达80％～90％融合，传代后生长加速；形态学类似骨髓源性MSC。脐血MSC均一稳定地表达MSC的相关抗原CD29、CD44、CD90，不表达CD34、CD45。经牛磺酸体外诱导后的脐血MSC中，3120个细胞中有2515个细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），3050个细胞中有903个细胞表达巢蛋白，3175个细胞中有1168个细胞表达视紫红质；未诱导组的2965个脐血MSC中仅有234个细胞表达NSE，其他抗原未见表达。两组间NSE、巢蛋白和视紫红质的表达差异具有统计学意义（X2=3242．9，1073．0，1444．5；P值均〈0．01）。结论人脐血MSC经rhEGF和牛磺酸诱导后能使部分MSC向神经元样细胞或视紫红质阳性细胞分化。 展开更多

关键词 干细胞/细胞学 脐血干细胞 细胞培养技术/方法 细胞分化/免疫学

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转瓶变速培养对微胶囊肝细胞聚集体形成及活性的影响

8

作者 陈滟珊 喻成波 +1 位作者 曹红翠 李兰娟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期403-409,共7页

目的：观察匀速与变速旋转培养对微胶囊HepLL永生化人肝细胞、HepG2肝细胞聚集体形成和活性的影响。方法：一步法海藻酸钠—壳聚糖（ AC）微胶囊包裹HepG2及HepLL细胞，随机分为两大组，每组按转速分3小组。动态观察并测量各组聚集体大... 目的：观察匀速与变速旋转培养对微胶囊HepLL永生化人肝细胞、HepG2肝细胞聚集体形成和活性的影响。方法：一步法海藻酸钠—壳聚糖（ AC）微胶囊包裹HepG2及HepLL细胞，随机分为两大组，每组按转速分3小组。动态观察并测量各组聚集体大小、数目变化，ELISA动态检测各组白蛋白合成量，比色法检测氨的清除量，高效液相色谱法检测安定转化功能。结果：与匀速旋转培养组相比，变速旋转培养组微胶囊细胞第6、8、10、12、14、16天聚集体平均个数、平均最大径、白蛋白合成量、氨清除量以及安定转化量均明显提高（均P＜0．01），微胶囊HepLL各组在各个时间点的白蛋白合成量、氨清除量及安定转化功能均优于HepG2（均P＜0．01）。结论：微胶囊转瓶变速培养显著加快微胶囊HepLL、HepG2细胞聚集体形成并提高细胞活性，未来HepLL有可能代替HepG2用于人工肝治疗。 展开更多

关键词 壳聚糖 胶囊 肝细胞/细胞学 培养基 细胞 培养的/细胞学 细胞培养技术/方法 旋转

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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的可行性研究

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作者 高斐 董方田 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期254-256,共3页

目的探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）向视网膜色素上皮（RPE）细胞分化的可行性。方法采用贴壁筛选法分离、培养Brown—Norway（BN）rMSCs。将反复冻融制成的BN大鼠RPE细胞裂解液加入到rMSCs培养体系中，鉴定被诱导的细胞是... 目的探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）向视网膜色素上皮（RPE）细胞分化的可行性。方法采用贴壁筛选法分离、培养Brown—Norway（BN）rMSCs。将反复冻融制成的BN大鼠RPE细胞裂解液加入到rMSCs培养体系中，鉴定被诱导的细胞是否同时表达RPE细胞的特征性标记物细胞角蛋白（CK）与S一100。结果经RPE细胞裂解液诱导的rMSCs生长速度减慢，细胞呈长梭形，周边有毛刺样突起。免疫印迹法和双重免疫荧光标记显示部分经诱导的细胞同时表达CK与S一100。流式细胞术显示14．1％的细胞能够同时表达CK与S-100。结论rMSCs经RPE细胞裂解液诱导后能够向RPE细胞方向分化。 展开更多

关键词 干细胞/细胞学 骨髓祖代细胞/免疫学 细胞培养技术/方法 细胞分化/免疫学 色素上皮 眼/细胞学 动物 实验

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兔羊膜成体干细胞培养及体外定向诱导神经细胞分化

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作者 徐蔚 王震 +2 位作者 曲申 刘思维 王培军 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期296-299,共4页

目的观察体外分离、培养的兔羊膜成体干细胞（ADsc）定向诱导神经细胞的分化结果。方法新西兰雌兔羊膜分离、培养ADSC。实时定量聚合酶链反应（PCR）检测羊膜ADSC的纤连蛋白（Fibronectin）、巢蛋白（Nestin）、波形蛋白（Vimentin）mRN... 目的观察体外分离、培养的兔羊膜成体干细胞（ADsc）定向诱导神经细胞的分化结果。方法新西兰雌兔羊膜分离、培养ADSC。实时定量聚合酶链反应（PCR）检测羊膜ADSC的纤连蛋白（Fibronectin）、巢蛋白（Nestin）、波形蛋白（Vimentin）mRNA的表达水平。单克隆形成实验证实羊膜ADSC是否具有自我复制能力。培养成功的ADSC中加入神经分化诱导培养基诱导神经细胞分化。诱导分化5d后，免疫荧光染色检测伊微管蛋白（tubulin）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果培养的ADSC在24h后逐渐从羊膜组织中移行出；72h可见明显的多角形细胞富集在羊膜组织周边；120h后多角形细胞致密地分布于羊膜四周。分裂后的子代细胞形态同父代细胞。单克隆形成实验结果证实羊膜ADSC具有自我复制能力。实时定量PCR检测结果显示，羊膜ADSC的Nestin、Vimentin、FibronectinmRNA分别是脾脏细胞同种分子表达量的15．79、1．91、7．65倍，两者差异有统计学意义（Z=-5．243、-3．972、-2．524，P〈0．05）。免疫荧光染色结果显示，β-tubulin在大部分细胞的胞质中表达；GFAP在部分细胞的细胞质中表达。结论羊膜ADSC具有自我复制能力，在合适条件下能够分化成神经元和神经胶质细胞。 展开更多

关键词 成体干细胞 细胞学 细胞分化 免疫学 细胞培养技术 方法 羊膜

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体外培养及诱导胚兔视网膜及脑神经干细胞分化的研究

11

作者 吴婵 董方田 +1 位作者 陈连凤 许卓再 《中华眼底病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期265-269,共5页

目的比较体外不同培养条件对视网膜及脑神经干细胞（NSCs）视紫红质的纯化能力及不同诱导条件对NSCs的诱导分化能力。方法取胚兔视网膜及大脑皮质制备单细胞悬液，分别在5种不同培养基中进行体外培养并纯化。选取无血清条件下传3代的NSC... 目的比较体外不同培养条件对视网膜及脑神经干细胞（NSCs）视紫红质的纯化能力及不同诱导条件对NSCs的诱导分化能力。方法取胚兔视网膜及大脑皮质制备单细胞悬液，分别在5种不同培养基中进行体外培养并纯化。选取无血清条件下传3代的NSCs，分别在2种培养基中诱导8～10d。采用免疫荧光法及流式细胞仪检测所获得细胞的神经干细胞和视网膜神经上皮细胞抗原的表达。结果免疫荧光法显示无血清培养条件下2种组织来源的NSCs均部分表达巢蛋白。流式细胞术显示2种诱导方式均部分细胞表达巢蛋白，较诱导前明显降低，而视紫红质及Thyl．1的表达均较诱导前明显增高。经5％胎牛血清（FBS）诱导的细胞表达视紫红质较联合应用全反式视黄酸（ATRA）时高，差异均有统计学意义（X2=30．59，6．76；P〈0．01），但Thyl．1表达低于后者，差异也有统计学意义（X2=6．19，22．92；P=0．01）。结论无血清培养基添加N2、EGF、bFGF、LIF4种因子可以获得最佳纯化效果。2种诱导培养基都能够诱导NSCs的分化，视网膜NSCs分化为视网膜神经上皮细胞的能力高于大脑皮质NSCs。 展开更多

关键词 干细胞/细胞学 细胞培养技术/方法 细胞分化/免疫学 神经上皮细胞/细胞学

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