结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因疫苗的构建及表达 被引量：4

1

作者 张海 师长宏 +5 位作者 薛莹 姜泓 高雪 柏银兰 王丽梅 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2005年第3期193-195,共3页

目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按... 目的:构建结核分枝杆菌esat6 cfp10融合基因疫苗 并对其在体外进行表达.方法:用PCR技术从MTB毒株 H37Rv基因组DNA中扩增cfp10基因,以HindⅢ和EcoRⅠ双 酶切后克隆入含esat6基因的pGEM 7zf(+)载体中,将测序 正确的esat6 cfp10融合基因按照BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定 正确后以脂质体转染CHO细胞,分别以RT PCR方法检测 mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达. 结果:PCR获得的cfp10基因序列与文献报道一致,大小约为 350bp.重组真核表达质粒酶切后可获得约630bp的融合 esat6 cfp10基因片段.RT PCR可获得大小约为350bp的 cfp10基因,间接免疫荧光检测后表达有Esat6 Cfp10蛋白的阳 性细胞着染.结论:成功克隆结核分枝杆菌cfp10基因,构建 了融合有esat6 cfp10基因的真核表达质粒并对其在体外进行 了表达. 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 cfp10 基因疫苗 真核表达

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结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的原核表达及其表达条件的优化 被引量：5

2

作者 杨晰朦 陈香梅 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2020年第3期286-292,共7页

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pE... 目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuber-culosis,MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白(recombinant ESAT6-CFP10,rEC),并优化表达条件。方法以(GGGGS)3为linker将ESAT6和CFP10两个基因连接,合成rEC全基因,插入至载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-rEC,转化至感受态E. coli BL21(DE3),筛选优势菌株进行诱导表达,并对诱导温度(25、30、37℃)、诱导剂种类及浓度(0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. 0 mmol/L IPTG及0. 5、1、5、10、15、20 g/L乳糖)、诱导时间(2、3、4、5、6 h)、诱导起始A600(0. 4、0. 6、0. 8、1. 0)进行优化。菌种经5 L发酵罐发酵培养后,采用亲和层析及离子交换层析纯化rEC融合蛋白,于-20℃分别储存0、2、4、6个月,12. 5%SDS-PAGE分析rEC融合蛋白,并对保存0、6月的样品进行HPLC-SEC分析。结果重组质粒pET-28a-rEC经双酶切及测序鉴定,构建正确。rEC融合蛋白最适诱导条件为:于30℃,以0. 1 mmol/L IPTG诱导4 h。纯化后rEC融合蛋白纯度达95%以上,且可与鼠抗ESAT6单克隆抗体发生特异性结合,于-20℃保存6个月未见蛋白降解及聚体产生。结论原核表达了rEC融合蛋白,并优化了其表达条件,获得的rEC融合蛋白具有较高纯度及稳定性。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 ESAT6 cfp10 基因重组 蛋白表达 稳定性

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牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因的原核表达及抗原反应性分析 被引量：2

3

作者 张健宁 方诗文 +6 位作者 刘思怡 包艳红 姚宇 黄永顺 王春芳 姜秀云 马红霞 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第22期71-76,共6页

为了增强单个蛋白在牛结核病诊断中的敏感性和抗感染中的免疫原性,试验采用重叠延伸PCR将牛分枝杆菌cfp10基因与esat6基因融合,得到cfp10-esat6融合基因,再行重叠延伸PCR将cfp10-esat6融合基因与cfp7基因融合,得到融合基因cfp10-esat6-c... 为了增强单个蛋白在牛结核病诊断中的敏感性和抗感染中的免疫原性,试验采用重叠延伸PCR将牛分枝杆菌cfp10基因与esat6基因融合,得到cfp10-esat6融合基因,再行重叠延伸PCR将cfp10-esat6融合基因与cfp7基因融合,得到融合基因cfp10-esat6-cfp7,并克隆至T-Vector pMD19中,构建重组质粒pMD-cfp10-esat6-cfp7。对pMD-cfp10-esat6-cfp7和pET-28a(+)进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将纯化的cfp10-esat6-cfp7连接到pET-28a(+)中,获得表达质粒pET-cfp10-esat6-cfp7,通过IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达质粒在E.coli BL21(DE3)中的表达情况。对表达的融合蛋白进行镍柱纯化,通过Western-blot和间接ELISA分析其抗原反应性。结果表明:获得了融合基因cfp10-esat6-cfp7,表达了约36.3 ku的融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7。融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阳性血清反应的OD492值均在0.6以上,而融合蛋白CFP10-ESAT6与阳性血清反应的OD492值在0.1~0.3之间;融合蛋白CFP10-ESAT6-CFP7与10份牛结核阴性血清的OD492值也明显高于CFP10-ESAT6,其与牛结核阳性血清呈现良好的反应性。说明CFP10-ESAT6-CFP7融合蛋白具有作为牛结核病诊断抗原用于新型疫苗研究的潜在价值。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 cfp10基因 esat6基因 cfp7基因 融合基因 原核表达

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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 被引量：4

4

作者 宫强 刘思国 +3 位作者 王牟平 王春来 彭永刚 沈国顺 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期340-342,共3页

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以... 以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 分泌蛋白 ESAT-6 cfp10 基因克隆 基因表达

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结核分枝杆菌CFP10的基因克隆及表达 被引量：2

5

作者 周丽蓉 徐敬华 +1 位作者 罗永艾 王国治 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期703-705,共3页

目的克隆结核分枝杆菌CFP10基因,在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究其在结核病诊断中的价值奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对CFP10的基因进行扩增,以PET-30a(+)为载体构建重组质粒,将重组质粒先转化入... 目的克隆结核分枝杆菌CFP10基因,在大肠杆菌中进行表达,为进一步研究其在结核病诊断中的价值奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR方法对CFP10的基因进行扩增,以PET-30a(+)为载体构建重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α中,抽提质粒,进行双酶切鉴定,再转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达形式。结果构建了具有正确基因序列的CFP10重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达。结论目的基因克隆入宿主菌中并表达成功,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 cfp10 基因克隆

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结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析 被引量：2

6

作者 丁淑琴 王淑静 +1 位作者 王洁 张焱 《宁夏医学杂志》 CAS 2010年第5期387-388,I0001,共3页

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因(CFP10),并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pG... 目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因(CFP10),并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 cfp10基因 克隆 序列分析

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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的克隆表达及纯化 被引量：2

7

作者 张海 师长宏 +5 位作者 范雄林 薛莹 柏银兰 姜泓 高雪 徐志凯 《科学技术与工程》 2005年第1期19-22,共4页

获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶... 获得esat6-cfp10重组蛋白,为研究其在结核病诊断和预防中的作用奠定一定基础。以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,克隆cfp10基因,将其插入到pGEM-7ZF(+)克隆载体后与esat6基因连接,构建含有esat6和cfp10融合基因的克隆载体pGEM-e6c10。酶切消化pGEM-e6c10重组质粒,将esat6-cfp10基因亚克隆到pPROEXTM HTb原核表达载体,经IPTG诱导后,可表达出分子量约28 kD的esat6-cfp10融合蛋白,重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的esat6-cfp10融合蛋白。Western blot证明表达重组蛋白有较好的免疫原性。 展开更多

关键词 ESAT6 cfp10 融合基因 表达 结核分枝杆菌

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结核分枝杆菌lhp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达 被引量：2

8

作者 陈全 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 江山 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2003年第3期284-287,333,共5页

目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体... 目的 :构建结核分枝杆菌 (MTb) 1hp -esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法 :用GeneSOEing法 ,将1hp基因和esat6基因体外重组 ,构建融合基因 ,克隆入pQE30质粒中进行表达。 结果 :构建的融合基因经测序证实完全正确 ,重组体转化表达菌DH5α后 ,经过IPTG诱导 ,表达出 2 6kDa左右的CFP10 -ESAT6融合蛋白。SDS -PAGE分析显示 ,IPTG诱导 4h表达量最高 ,表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中 ,表达量占全菌蛋白质的 4 0 % ,Westernblotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni-NTA柱纯化后 ,获得了纯度为 98%的重组蛋白。结论 :成功构建MTblhp -esat6融合基因 ,成功构建原核表达载体pQE30 -CFP10 -ESAT6 ,并获得重组CFP10 -ESAT6融合蛋白 ,为MTb重组抗原的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 1hp—esat6融合基因 重组cfp10一ESAT6 原核表达

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表达牛分枝杆菌esat-6和cfp-10基因的重组流产布氏杆菌S19疫苗株的构建及毒力评估 被引量：1

9

作者 刘翠翠 王佳莹 +4 位作者 马思思 吴云燕 易琳 赵明秋 陈金顶 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期395-401,共7页

通过overlap PCR扩增了含有bp26基因上游片段、bp26基因下游片段及牛分枝杆菌esat6-cfp10基因的目的片段Δbp26-ec,利用含有sacB基因的自杀质粒pRE112为载体,通过等位基因交换的方法,将构建好的自杀质粒电转入已经构建好的缺失bp26基因... 通过overlap PCR扩增了含有bp26基因上游片段、bp26基因下游片段及牛分枝杆菌esat6-cfp10基因的目的片段Δbp26-ec,利用含有sacB基因的自杀质粒pRE112为载体,通过等位基因交换的方法,将构建好的自杀质粒电转入已经构建好的缺失bp26基因的流产布氏杆菌减毒活疫苗S19突变株中,构建了具有非抗性基因标记的突变株S19-Δbp26-ec,并对构建好的新型基因突变株进行了生物学特性及毒力的鉴定及分析。PCR及核苷酸序列测序结果显示,S19-Δbp26-ec构建成功。与亲本株相比,疫苗株S19-Δbp26-ec的生长特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示,S19-Δbp26-ec株具有良好的遗传稳定性。被感染小鼠脾重和脾中菌落数表明,S19-Δbp26-ec的毒力最弱,S19和S19-Δbp26次之。上述结果表明,本试验获得了毒力减弱的基因突变株S19-Δbp26-ec,为牛布氏杆菌病-结核病二联疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 流产布氏杆菌 esat6-cfp10基因 基因突变株 毒力

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结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因原核表达载体的构建及表达

10

作者 李红霞 陈建平 +6 位作者 刘刚 姚卫 杨筠 刘杨椅 曾林子 田玉 王涛 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2007年第3期636-640,共5页

构建结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白CFP10-ESAT6。用基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6。重组子... 构建结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白CFP10-ESAT6。用基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside,异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达约42kDa带谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-TransferasesGST)蛋白标签的rCFP10-ESAT6融合蛋白,经谷胱苷肽硫转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定。重组质粒pGcfp10-esat6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。本研究成功构建了原核表达载体pGcfp10-esat6,获得了rCFP10-ESAT6融合蛋白,为rCFP10-ESAT6融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 cfp10-esat6融合基因 rcfp10-ESAT6融合蛋白 原核表达

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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 被引量：8

11

作者 李娟 吴雪琼 +3 位作者 张俊仙 李香兰 张灵霞 梁建琴 《中国防痨杂志》 CAS 北大核心 2004年第4期204-208,共5页

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a... 目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法　通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果　重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌 cfp10-ESAT6融合蛋白 大肠杆菌 免疫学 基因表达

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牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达 被引量：5

12

作者 房红莹 马魁 +5 位作者 张欣 崔敏 陈钜豪 蒋启荣 刘付启荣 罗满林 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期504-509,共6页

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到... 以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到了融合基因。将融合基因片段先克隆于pMD18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 ESAT-6基因 cfp-10基因 融合表达

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结核杆菌CFP-10／ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究 被引量：1

13

作者 李岩 鲍朗 +3 位作者 张会东 商正玲 钟琪 李娅莎 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1076-1079,共4页

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-1... 目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。 展开更多

关键词 cfp-10 ESAT-6 融合基因 重组耻垢分枝杆菌 巨噬细胞

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牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化 被引量：1

14

作者 谢志勤 谢芝勋 +4 位作者 邓显文 谢丽基 庞耀珊 刘加波 范晴 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期360-365,共6页

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a(+)为载体构建重组表达载体CFP-10/pET32a(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.9mmol/L IPTG37℃诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂... 根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a(+)为载体构建重组表达载体CFP-10/pET32a(+)。重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.9mmol/L IPTG37℃诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS-PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni-NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95%,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 cfp-10基因 表达 纯化

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结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析 被引量：2

15

作者 宋广忠 石君帆 +3 位作者 漏磊君 李召东 泮结超 John T.Belisle 《国际流行病学传染病学杂志》 CAS 2011年第2期100-104,共5页

目的构建结核分枝杆菌H37Rv株esat．6-cfp-10（简称ec）融合基因及其原核表达载体pET-23b（＋）．esat．6-cfp-10[以下简称pE％23b（＋）-ec]，表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10（简称rEC），并分析其免疫反应性。方法采用基因拼接技术... 目的构建结核分枝杆菌H37Rv株esat．6-cfp-10（简称ec）融合基因及其原核表达载体pET-23b（＋）．esat．6-cfp-10[以下简称pE％23b（＋）-ec]，表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10（简称rEC），并分析其免疫反应性。方法采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-IO编码基因用疏水甘氨酸接头（Gly4Ser），进行PCR扩增融合。构建TA克隆载体pMDR19-T-esat-6-cfp-10（简称pMD-19-T-ec），利用PCR、酶切和测序进行鉴定。经限制性内切酶NdeI、XhoI双酶切后将融合基因定向克隆入原核表达载体pET-23b（＋）。将构建正确的重导组质粒pET-23b（＋）-ec转化E-coliBL21（DE3）pLysE，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPm）诱导rEC的表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法分析其表达情况。用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。用Western印迹初步评价融合蛋白的免疫反应性。结果融合基因及其原核表达载体构建成功，融合蛋白以可溶性非包涵体形式表达，相对分子质量为21000，表达量约占菌体总蛋白的35％。经亲和层析后得到了纯度达97．2％的融合蛋白。Western印迹证实，融合蛋白能与确诊的肺结核患者血清发生特异性免疫应答。结论成功构建了原核表达载体pET-23b（＋）-ec，获得了rEC融合蛋白，为rEC融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 分枝杆菌 结核 esttt-6-cfp10 融合基因 rESAT-6-cfp-10融合蛋白

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