环酰亚胺水解酶C末端区为该酶活性所必需 被引量：1

1

作者 石亚伟 陈云霞 +1 位作者 崔丽方 袁静明 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期141-146,共6页

为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端2个Lvs替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE—cih293为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩... 为了研究一个新环酰亚胺水解酶（CIH）C端区残基对酶分子构象及酶活性的影响，设计了C末端缺失1～4个氨基酸残基以及C-末端2个Lvs替代为2个Glu或2个Leu的突变酶，以野生型酶基因重组质粒pE—cih293为模板，在相应引物存在下，通过PCR扩增获得突变的CIH基因片段．经克隆、表达与纯化，得到不同的突变酶蛋白．酶活性测定、荧光光谱与CD谱分析表明，随着C-末端缺失残基的增多，酶活性丧失也越来越多，但酶分子的聚合状态未发生变化；当CIH的C末端2个Lys替代为2个Glu时，酶活性及分子结构变化均不明显，但当替代为2个Leu时，酶活性丧失殆尽，分子结构变得松散而不再保持寡聚态．pH及热稳定性实验也表明。酶的稳定性与其分子的完整性密切相关．结果证实，CIH的C末端电荷残基对该酶活性与分子状态具有重要作用． 展开更多

关键词 环酰亚胺水解酶 c-末端区 带电荷氨基酸 分子构象 稳定性

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EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选 被引量：2

2

作者 余琳 张雪雁 杨英 《热带医学杂志》 CAS 2010年第4期406-409,444,共5页

目的利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析柱加酶切的方法纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进... 目的利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒(EBV)LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析柱加酶切的方法纯化CTAR23蛋白,并用其筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析。结果对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果。ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100%,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS。结论噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础。 展开更多

关键词 EB病毒 潜伏膜蛋白1 cTAR23 噬菌体随机肽库

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沙粒病毒聚合酶C端的表达纯化与结晶条件筛选 被引量：1

3

作者 景佳美 徐欣 +2 位作者 王敏 彭如超 施一 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期18-23,共6页

拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端... 拉沙病毒和马秋波病毒同属于沙粒病毒科,人类感染后病死率很高,对人类生命健康造成了严重威胁。沙粒病毒在基因组转录过程中存在与其他分节段负链RNA病毒相似的抢帽机制,位于病毒聚合酶N端的核酸内切酶结构域负责切割宿主mRNA,而其C端负责结合宿主mRNA帽子。目前对哺乳动物沙粒病毒聚合酶C端的特征知之甚少。为此构建了拉沙病毒和马秋波病毒聚合酶C端的重组表达载体,并利用E. coli原核系统进行表达和后续纯化,获得了不同聚体形式的C端蛋白,通过分析超速离心实验和负染电镜观察对其不同的聚体形式进行了表征。最后通过大量筛选结晶条件,得到了拉沙病毒聚合酶C端的晶体,为进一步研究其三维结构和功能机制奠定了基础。 展开更多

关键词 拉沙病毒 马秋波病毒 聚合酶c端 表达纯化 结晶

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PICK1蛋白C端酸性区域对其功能的调节 被引量：1

4

作者 贾原 黄玉民 +1 位作者 刘俊林 石亚伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期224-230,共7页

蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with Ckinase1,PICK1)是调节AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体在细胞膜上的数量与分布,引起LTP与LTD现象的重要蛋白.本文利用基因克隆、荧光光谱以及... 蛋白激酶C相互作用蛋白1(protein interacting with Ckinase1,PICK1)是调节AMPA(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受体在细胞膜上的数量与分布,引起LTP与LTD现象的重要蛋白.本文利用基因克隆、荧光光谱以及免疫分析等方法,分析了PICK1蛋白C末端酸性区对BAR结构域与膜脂结合能力以及PICK1分子内BAR(Bin/amphiphysin/RVS)结构域与PDZ结构域相互作用的影响,研究了钙离子结合C末端酸性区后对上述相互作用的调节.结果显示,C末端酸性区的存在使BAR结构域与膜脂的结合能力减弱大约10倍,但PICK1分子内的BAR与PDZ结构域的相互作用与不含C末端的酸性区相比增强了大约4倍.另一方面,C末端酸性区的存在,伴随钙离子浓度的提高,有助于增强BAR与膜脂的结合,却削弱了PDZ和BAR结构域的作用.当钙离子浓度增加到500μmol/L时,BARC的脂质结合能力以及和PDZ的亲和力与不含酸性区相当. 展开更多

关键词 蛋白激酶c相互作用蛋白1 BAR结构域 c末端酸性区 脂质体 钙离子

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杆状病毒Ac78 C末端保守区域的功能初步分析 被引量：1

5

作者 李赛男 杨凯 +1 位作者 刘文华 赵海洲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期748-756,共9页

杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的orf78（即Ac78）是最近被发现的杆状病毒核心基因，在杆状病毒的生活周期中具有重要功能．氨基酸序列分析表明，Ac78的C末... 杆状病毒模式种苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）的orf78（即Ac78）是最近被发现的杆状病毒核心基因，在杆状病毒的生活周期中具有重要功能．氨基酸序列分析表明，Ac78的C末端105～108位氨基酸区域在GroupINPVs旁系同源物中高度保守．为研究该保守区域在Ac78功能中的作用，利用Bac—to-Bac杆状病毒表达载体系统成功构建了缺失该保守区域，并且携带绿色荧光蛋白基因和多角体蛋白基因的Ac78截短补回型重组病毒（vAe78：del105．108）．荧光显微镜分析和病毒生长曲线测定结果表明，在vAc78：del105．108转染的Sf9细胞中，感染性的芽生型病毒粒子（buddedvirion，BV）产生量与Ac78全长补回型重组病毒（vAc78：HA）基本一致；电镜观察发现，在vAc78：del105．108转染的细胞中，呈现与vAc78：HA的现象一致的典型的杆状病毒感染特征，多粒包埋型病毒粒子（multiple nucleocapsid—enveloped occlusion-derived virion，M—ODV）以及包埋有M-ODV的包涵体均能正常形成；免疫荧光实验表明，在vAc78：del105．108感染的Sf9细胞中，从病毒感染细胞24h时开始，Ac78专一定位于感染细胞的内核膜附近，与vAc78：HA的现象一致．上述结果表明，Ac78的C末端105-108位氨基酸保守区域对于BV和M—ODV的有效产生以及Ac78的亚细胞定位非必需． 展开更多

关键词 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 c末端保守区域 芽生型病毒粒子 多粒包埋型病毒粒子

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EB病毒LMP1-CTAR2结构域的原核表达及蛋白质纯化 被引量：1

6

作者 余琳 张雪雁 李孜 《中国卫生检验杂志》 CAS 2010年第7期1583-1585,共3页

目的:构建LMP1-CTAR2原核表达载体,纯化LMP1羧基端活化区2(CTAR2)蛋白。方法:通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBVLMP1 CTAR2 cDNA,克隆至PGEM-T载体后测序。运用亚克隆技术构建PGEX-6P-3-CTAR2重组表达载体。用SDS-PAGE与western blot... 目的:构建LMP1-CTAR2原核表达载体,纯化LMP1羧基端活化区2(CTAR2)蛋白。方法:通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBVLMP1 CTAR2 cDNA,克隆至PGEM-T载体后测序。运用亚克隆技术构建PGEX-6P-3-CTAR2重组表达载体。用SDS-PAGE与western blot对表达产物进行鉴定,利用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行分离和纯化。结果:PCR扩增出225 bp的基因片段,测序结果与已知的LMP1 CTAR2序列吻合。成功构建PGEX-6P-3-CTAR2原核表达载体,western blot分析表明表达产物能与抗LMP1单克隆抗体特异结合。成功分离出Mr约37000的PGEX-6P-3-CTAR2融合蛋白,纯化出Mr约15000的LMP1 CTAR2蛋白。结论:成功获得EBV LMP1 CTAR2蛋白,可用于噬菌体筛库和CTAR2致瘤机制研究。 展开更多

关键词 EPSTEIN-BARR病毒 羧基端活化区2 原核表达 蛋白质纯化

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海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达 被引量：1

7

作者 姜启晨 丛丽娜 +2 位作者 宋明徽 谭广毅 卢冬 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2013年第6期395-398,共4页

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上... 为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。 展开更多

关键词 海参溶菌酶c端多肽 毕赤酵母 重组表达

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重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞因子分泌的影响

8

作者 张倩 马越云 +3 位作者 朱琳 刁艳君 苏明权 郝晓柯 《山西医科大学学报》 CAS 2012年第2期91-94,共4页

目的研究重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌细胞因子的影响。方法原核表达并纯化重组HBHA,N端缺失HBHA(HBHA-ΔN)、C端缺失HBHA(HBHA-ΔC)三种蛋白,用以刺激A549细胞,并设置阴性对照,观察A549细胞分泌细胞因子的情况。结果 rHBHA蛋白... 目的研究重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌细胞因子的影响。方法原核表达并纯化重组HBHA,N端缺失HBHA(HBHA-ΔN)、C端缺失HBHA(HBHA-ΔC)三种蛋白,用以刺激A549细胞,并设置阴性对照,观察A549细胞分泌细胞因子的情况。结果 rHBHA蛋白可以显著提高A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ的水平,而HBHA-△N和HB-HA-△C蛋白对A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ和IL-10的作用无显著影响。结论 rHBHA能够促进IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ分泌,N端和C端缺失后促进作用减弱。提示HBHA在诱导自然免疫以及抵抗结核菌感染中具有重要作用。 展开更多

关键词 rHBHA HBHA-Δc HBHA-ΔN 肺泡Ⅱ型上皮细胞 细胞因子

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EB病毒潜伏膜蛋白1羧基端活化区域2蛋白特异性结合短肽的筛选

9

作者 张雪雁 杨英 余琳 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2011年第5期429-433,共5页

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒潜伏膜蛋白1（LMPl）羧基端活化区域（CTAR）2蛋白特异性结合的短肽.方法 用纯化的CTAR2蛋白筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CTAR2蛋白的亲和力.利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行... 目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒潜伏膜蛋白1（LMPl）羧基端活化区域（CTAR）2蛋白特异性结合的短肽.方法 用纯化的CTAR2蛋白筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CTAR2蛋白的亲和力.利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 CTAR2蛋白对噬菌体12肽库进行3轮筛选,第3轮的产率是第1轮的143倍[（3.0×10^-6）/（2.1×10^-8）],噬菌体克隆得到较好的富集.ELISA方法提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR2蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％.测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列：GLKHHSPGLLLY.结论 筛选出与CTAR2蛋白特异性结合的短肽序列GLKHHSPGLLLY,为研究LMP1致瘤机制和开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物提供实验依据. 展开更多

关键词 EB病毒 潜伏膜蛋白1 c端活化区域2 噬菌体随机肽库 鼻咽癌

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制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

10

作者 汪惠 赖百塘 +4 位作者 李伟英 杨学惠 张春燕 韦攀健 李金照 《中国肺癌杂志》 CAS 2010年第5期470-476,共7页

背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺... 背景与目的p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scatter plot,FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scatter plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。 展开更多

关键词 野生型P53 缺失c-末端p53 3’端非编码区 重组腺病毒 流式细胞仪散点图 绿荧光蛋白表达

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幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白C-末端区域疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染

11

作者 贺军 孙勇 陈雅华 《现代消化及介入诊疗》 2010年第2期63-65,共3页

目的在人类幽门螺杆菌(Hp)感染的C57BL/6小鼠模型中,研究中性粒细胞激活蛋白C-末端区域疫苗治疗Hp感染的作用。方法把已感染Hp的C57BL/6小鼠分成4组,分别通过灌胃法给予单纯中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白(100μg)、中性粒细胞激活蛋白C... 目的在人类幽门螺杆菌(Hp)感染的C57BL/6小鼠模型中,研究中性粒细胞激活蛋白C-末端区域疫苗治疗Hp感染的作用。方法把已感染Hp的C57BL/6小鼠分成4组,分别通过灌胃法给予单纯中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白(100μg)、中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白(100μg)加霍乱毒素(CT,2μg)、单纯CT(2μg)或PBS,每周1次,共4次,治疗4周后处死动物,取胃黏膜行半定量细菌培养检查Hp情况。结果治疗后各组Hp根除率分别为:中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白加CT组50%(5/10),单纯中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白组、单纯CT组及PBS组根除率均为0%。统计分析表明中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白加CT组的H.pylori根除率较其它组有显著性差异(P<0.05)。此外,未根除Hp的小鼠,中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白加CT组Hp的定植密度明显低于其它3组(P<0.05)。结论中性粒细胞激活蛋白C-末端蛋白能够作为Hp多价治疗疫苗的组分之一。 展开更多

关键词 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白c-末端蛋白 疫苗

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制备两种P53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达

12

作者 汪惠 赖百塘 +4 位作者 李伟英 杨学惠 张春燕 韦攀健 李金照 《结核病与胸部肿瘤》 2010年第2期77-83,共7页

目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流... 目的P53作为转录因子在细胞应激时呈活化型，调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长，通常，通过各种机制P53呈非活化状态，其中包括P53C-末端负调控序列的作用。该研究目的是制备携带垒长和缺失这些负调控序列P53两种重组腺病毒和用流式细胞仪散点图（Flow cytometry scatter plot，FCM）检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）表达。材料和方法利用pAdEasy-Track载体系统，构建两种P53重组质粒并在细菌中产生重组体，转染L293细胞产生三种重组腺病毒。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞，FCM分析GFP表达。结果测序证明重组腺病毒：Ad—P53（del）缺失p53C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区，Ad—P53（wtp）没有P53碱基缺失。Ad（empty carrier）无P53。FCM scatter plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端P53和全长p53两种重组腺病毒，Ad—p53（del），Ad-p53（wtp）及空载体Ad-（empty）。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠，可定量外源GFP表达，为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。 展开更多

关键词 野生型P53 缺失c-末端P53 3’端非编码区 重组腺病毒 流氏细胞仪散点图 绿荧光蛋白表达

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