目的:构建携带小鼠MHCII类分子反式激活因子(MHC class II molecule transactivator,CIITA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能。方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔...目的:构建携带小鼠MHCII类分子反式激活因子(MHC class II molecule transactivator,CIITA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能。方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得IV型CIITA cDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CIITAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响。结果:成功克隆了小鼠CIITA突变体基因,并构建了携带小鼠CIITA突变体基因的重组腺病毒Ad-CIITAm;经流式细胞术证实感染Ad-CIITAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制。结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CIITA突变体在体外能够有效地抑制MHCII类分子的表达。展开更多
目的:评价cⅡTA(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性,为改造MHC分子奠定基础。方法:用PCR、酶切及连接技术,构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2,含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3...目的:评价cⅡTA(MHC class Ⅱ transactivator,CⅡTA)基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性,为改造MHC分子奠定基础。方法:用PCR、酶切及连接技术,构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2,含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3突变体及CⅡTA基因的反义RNA-pcDNA3/CⅡTA反。用脂质体转染法,将突变体、反义RNA及空载体pcDNA3转入PIEC细胞和L23细胞中。持续四个月,流式细胞术观察它们对PIEC/L23细胞株MHCⅡ类(SLA-DR)分子的诱导性和组成性表达的影响。结果:转染pcDNA3、pcDNA3mCⅡTA2后,PIEC/L23细胞SLA-DR的表达没有受到抑制,转染pcDNA3mCⅡTA3后,9/20(45．0％)的PIEC细胞、10/20(50．0％)的L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达 90％以上;转染pcDNA3mCⅡTA反后,7/15(46．7％)PIEC细胞、5/15(33．3％)L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制,抑制率高达85％以上。持续检测4个月,转染pcDNA3mCⅡTA3的PIEC/L23细胞SLA-DR的表达受抑率均在90％以上。转染反义 RNA的PIEC/L23细胞在第65/45天,SLA-DR表达抑制率降至10％以下。结论:构建成功的CⅡTA突变体和反义RNA均能有效抑制SLA-DR表达,但CⅡTA突变体稳定存在于胞内的时间长,构建突变体是利用CⅡTA抑制MHCⅡ类分子的好方法。展开更多
目的:探究CⅡTA在慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)发病中对胶原纤维沉积和炎症反应的可能作用及机制。方法:构建野生型鼻息肉小鼠模型和CⅡTA^(-/-)小鼠鼻息肉模型,选取小鼠鼻腔外侧壁组织,通过H...目的:探究CⅡTA在慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)发病中对胶原纤维沉积和炎症反应的可能作用及机制。方法:构建野生型鼻息肉小鼠模型和CⅡTA^(-/-)小鼠鼻息肉模型,选取小鼠鼻腔外侧壁组织,通过HE染色法观察各组小鼠鼻黏膜组织的形态学结构及炎性细胞浸润情况。通过Masson三色胶原染色法观察细胞外基质中胶原沉积情况,ELISA检测鼻腔灌洗液中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-17)的表达情况。结果:NP小鼠组黏膜下炎性细胞浸润增多、胶原沉积增加,灌洗液中炎性因子浓度升高鼻腔。同WT+NP组小鼠相比,CⅡTA^(-/-)+NP小鼠的黏膜病理学变化减轻,炎性因子浓度降低。结论:小鼠不表达CⅡTA可能通过减少黏膜下胶原纤维沉积和减轻炎症反应的方式延缓鼻息肉的发展。展开更多
文摘目的:构建携带小鼠MHCII类分子反式激活因子(MHC class II molecule transactivator,CIITA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能。方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得IV型CIITA cDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CIITAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响。结果:成功克隆了小鼠CIITA突变体基因,并构建了携带小鼠CIITA突变体基因的重组腺病毒Ad-CIITAm;经流式细胞术证实感染Ad-CIITAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制。结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CIITA突变体在体外能够有效地抑制MHCII类分子的表达。
文摘目的:探究CⅡTA在慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)发病中对胶原纤维沉积和炎症反应的可能作用及机制。方法:构建野生型鼻息肉小鼠模型和CⅡTA^(-/-)小鼠鼻息肉模型,选取小鼠鼻腔外侧壁组织,通过HE染色法观察各组小鼠鼻黏膜组织的形态学结构及炎性细胞浸润情况。通过Masson三色胶原染色法观察细胞外基质中胶原沉积情况,ELISA检测鼻腔灌洗液中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及炎症因子(TNF-α、IL-6和IL-17)的表达情况。结果:NP小鼠组黏膜下炎性细胞浸润增多、胶原沉积增加,灌洗液中炎性因子浓度升高鼻腔。同WT+NP组小鼠相比,CⅡTA^(-/-)+NP小鼠的黏膜病理学变化减轻,炎性因子浓度降低。结论:小鼠不表达CⅡTA可能通过减少黏膜下胶原纤维沉积和减轻炎症反应的方式延缓鼻息肉的发展。
