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Bt杀虫基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内生优势菌中的转化研究 被引量：5
1
作者 何伟 王中康 +3 位作者 陈金华 李强 曹月青 殷幼平 《氨基酸和生物资源》 CAS 2008年第3期5-10,共6页
桑粒肩天牛(Apriona germariHope,Ag)幼虫是一种营钻蛀性生活的重要林业害虫,通过传统纯培养、生理生化鉴定和16SrDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定出其肠道优势内生菌溶血葡萄球菌(Staphylococcus haem olyticus,S.haem olytic-us)A... 桑粒肩天牛(Apriona germariHope,Ag)幼虫是一种营钻蛀性生活的重要林业害虫,通过传统纯培养、生理生化鉴定和16SrDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定出其肠道优势内生菌溶血葡萄球菌(Staphylococcus haem olyticus,S.haem olytic-us)Ag06菌株和人葡萄球菌(Staphylococcus hom is)Ag08菌株。从中筛选菌株S.haem olyticusAg06进行质粒消除后作为出发菌株,利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力B t杀虫基因cry3A的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305 a和pHT7911分别转入其中。经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试等分析,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的优势内生菌溶血葡萄球菌中。 展开更多
关键词 桑粒肩天牛幼虫 肠道内生优势菌 bt杀虫基因 cry3A 转化
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特异性杀虫基因Bt cry3A在桑粒肩天牛幼虫两种肠道常驻内生菌中的转化和表达 被引量：3
2
作者 王中康 何伟 +3 位作者 彭国雄 夏玉先 李强 殷幼平 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1168-1174,共7页
【目的】将特异性杀虫毒蛋白基因Btcry3A转入桑粒肩天牛(Apriona germari Hope,Ag)幼虫肠道常驻内生菌中,构建能在天牛幼虫肠道中定殖并表达特异性杀虫基因Bt cry3A的工程菌。【方法】以传统方法和16S rDNA分子生物学分析等方法分离、鉴... 【目的】将特异性杀虫毒蛋白基因Btcry3A转入桑粒肩天牛(Apriona germari Hope,Ag)幼虫肠道常驻内生菌中,构建能在天牛幼虫肠道中定殖并表达特异性杀虫基因Bt cry3A的工程菌。【方法】以传统方法和16S rDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定Ag幼虫肠道优势的常驻内生菌,从中筛选出适合转化的候选菌株。利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力Bt cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305a和pHT7911分别转入Ag幼虫肠道常驻内生菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis Ag12,Ag12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Ag13,Ag13)中。【结果】从Ag幼虫肠道共分离获得18个不同种的可培养细菌菌株,并从中选取菌株Ag12和Ag13作为出发菌株转入Bt cry3A基因。经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试、伴胞晶体电镜检测、毒蛋白SDS-PAGE分析、工程菌定殖性分析以及生物毒力测试,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的常驻内生菌短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中,并且工程菌Ag12-305a、Ag13-305a、Ag12-7911和Ag13-7911都能在天牛幼虫肠道内稳定生长、繁殖并表达分子量约65kDa的伴孢晶体杀虫蛋白Cry3A。【结论】Bt cry3A基因已成功转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势常驻内生菌中,获得了四株能在桑粒肩天牛幼虫肠道内定殖,并能表达目的杀虫基因Bt cry3A的转基因工程菌。 展开更多
关键词 桑粒肩天牛 肠道常驻内生菌 bt cry3A 工程菌 表达
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AcNPV polyhedrin与cry3Aa基因的重组与重组融合蛋白在大肠菌中的表达
3
作者 高博 邓柳红 +1 位作者 易小平 张春发 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第S1期65-69,共5页
目的:将cry3Aa基因与斜纹夜蛾多角体蛋白(AcNPV Polyhedrin)基因重组,构建重组蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:首先以PHT305a载体质粒DNA为模板,PCR扩增cry3Aa基因。再以PET30a-ph-1a载体质粒DNA为模板,PCR扩增多角体蛋白基... 目的:将cry3Aa基因与斜纹夜蛾多角体蛋白(AcNPV Polyhedrin)基因重组,构建重组蛋白原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:首先以PHT305a载体质粒DNA为模板,PCR扩增cry3Aa基因。再以PET30a-ph-1a载体质粒DNA为模板,PCR扩增多角体蛋白基因。将两基因片段分别连入PMD18-T克隆载体,测序鉴定。表达载体的构建分为两步,先将SacI和XhoI双酶切下来的cry3Aa基因连入表达载体pET30a,再将PMD18T-Ph经BglⅡ和SacI双酶切,所获得的ph基因片段与具有BglⅡ/SacI末端的pET30a-cry3Aa相连接,构建表达载体pET30a-cry3Aa-ph,表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导蛋白表达并纯化,SDS-PAGE分析结果。结果:cry3Aa和AcNPV Polyhedrin基因序列与报道完全一致。1mmol/LIPTG诱导4h表达的外源蛋白,经SDS-PAGE分析显示在大约103kDa处有表达产物特异条带。结论:获得cry3Aa与polyhedrine基因的重组蛋白工程菌株,为此基因应用于杀虫剂奠定了基础。 展开更多
关键词 bt cry3Aa ACNPV POLYHEDRIN 重组 表达
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暗黑鳃金龟碱性磷酸酶HpALP的基因克隆、表达及其与Bt Cry8Ea3的结合特性
4
作者 乔英翠 赵丹 +3 位作者 王哲 陆秀君 郭巍 李瑞军 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期409-416,共8页
【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据,PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)基因HpALP全长cDNA序列... 【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据,PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)基因HpALP全长cDNA序列;利用原核表达系统在体外表达HpALP,并进行Western blot检测;利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平;利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析。【结果】得到了暗黑鳃金龟HpALP全长cDNA(GenBank登录号:MZ004964),长1536 bp,编码512个氨基酸,预测蛋白质分子量为57.32 kD,等电点为4.70;HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高;原核表达获得重组蛋白HpALP,经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高。qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明,HpALP在幼虫前肠中丰度最高。HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合,解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L,最大亲合力Bmax值为0.59±0.068;而HpALP重组蛋白与对照Cry1Ab35不结合,Kd值为142.50±137.30 nmol/L,Bmax值为0.013±0.005。【结论】分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白,它与Bt Cry8Ea3亲和力强,推断其为Cry8Ea3的受体蛋白。研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 暗黑鳃金龟 碱性磷酸酶 bt cry8Ea 配体印记 ELISA
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把合成基因Bt—cry3A和自然抗性机理结合到马铃薯中以控制甲虫侵害
5
作者 JosephJ.Coombs DavidS.Douches 谢国禄 《国外作物育种》 2003年第2期48-49,共2页
关键词 马铃薯 甲虫 抗性机制 自然抗性机制 合成基因bt-cry3A 害虫治理
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