目的表达并纯化重组脑膜炎球菌P64K蛋白，观察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌中表达P64K蛋白，用硫酸铵盐析沉淀和两步层析纯化P64K蛋白。以重组P64K蛋白为载体蛋白，以已二酰肼为连接剂，在碳化二亚胺的作用下，将P64K蛋...目的表达并纯化重组脑膜炎球菌P64K蛋白，观察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌中表达P64K蛋白，用硫酸铵盐析沉淀和两步层析纯化P64K蛋白。以重组P64K蛋白为载体蛋白，以已二酰肼为连接剂，在碳化二亚胺的作用下，将P64K蛋白与活化的A群脑膜炎球菌多糖（group A meningococcal polysaccharide, GAMP）结合，制备GAMP-P64K结合物。免疫BALB／c小鼠，间接ELISA法测定血清特异性抗P64K蛋白和GAMPIgG抗体，分析P64K蛋白的免疫原性。结果重组P64K蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达，表达量约占菌体总蛋白的35％。动物实验证明，重组P64K蛋白具有较强的免疫原性，表明P64K蛋白具有载体蛋白作用。结论在大肠杆菌中成功表达了重组P64K蛋白，以重组P64K蛋白为载体制备的GAMP—P64K结合物具有良好的免疫原性。这为以重组P64K蛋白为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。展开更多
文摘本研究旨在确立兔波氏杆菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)最佳制备工艺。以兔波氏杆菌毒力较强菌株FX-1为研究对象,筛选出制备OMVs的最优方法,并对培养时间、抗生素添加量及过滤方法进行逐一优化。采用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)等方法分析OMVs的理化性质;采用考马斯亮蓝法(Bradford法)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测OMVs的蛋白质含量及组分。试验结果显示,超滤浓缩法是制备兔波氏杆菌OMVs的较适方法,采用该方法的最佳培养时间、头孢氨苄质量浓度和过滤方法分别为18 h、64μg/mL和0.45μm滤膜过滤一次。制得的OMVs呈纳米级球形囊泡,平均直径为127.83 nm±0.68 nm。蛋白质分析结果表明,OMVs上包含多种与兔波氏杆菌毒力和感染机制有关的蛋白质。该制备工艺能够显著提高兔波氏杆菌OMVs的产量,为其工业化生产提供了可能;对其结构和蛋白质成分的分析,为研发新型亚单位疫苗提供了科学依据。
文摘目的表达并纯化重组脑膜炎球菌P64K蛋白，观察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌中表达P64K蛋白，用硫酸铵盐析沉淀和两步层析纯化P64K蛋白。以重组P64K蛋白为载体蛋白，以已二酰肼为连接剂，在碳化二亚胺的作用下，将P64K蛋白与活化的A群脑膜炎球菌多糖（group A meningococcal polysaccharide, GAMP）结合，制备GAMP-P64K结合物。免疫BALB／c小鼠，间接ELISA法测定血清特异性抗P64K蛋白和GAMPIgG抗体，分析P64K蛋白的免疫原性。结果重组P64K蛋白在大肠杆菌中主要以可溶性形式表达，表达量约占菌体总蛋白的35％。动物实验证明，重组P64K蛋白具有较强的免疫原性，表明P64K蛋白具有载体蛋白作用。结论在大肠杆菌中成功表达了重组P64K蛋白，以重组P64K蛋白为载体制备的GAMP—P64K结合物具有良好的免疫原性。这为以重组P64K蛋白为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。
