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生物素修饰蛋白真核表达载体的构建与应用 被引量：9
1
作者 伦新新 胡志嵩 +6 位作者 陈园坤 李昂 张孟德 张明铭 赵晶 杨安钢 阎博 《医学分子生物学杂志》 CAS 2019年第1期1-6,共6页
目的构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索最适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法。方法采用PCR和引物退火的方法,得到BmA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至peDNA^... 目的构建生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA,并摸索最适生物素的添加剂量,提高目的蛋白表达水平和生物素修饰效率,从而优化生物素修饰蛋白制备方法。方法采用PCR和引物退火的方法,得到BmA基因片段和Avi-tag序列,而后定向克隆至peDNA^TM3.1载体骨架上,构建得到生物素修饰蛋白真核表达载体pAvi-BirA。应用PCR方法扩增Her2胞外段-Fc基因片段,定向克隆至载体pAvi-BirA上;将该质粒瞬时转染HEK293F细胞,并在培养液中添加不同剂量的生物素.通过Western印迹检测BirA酶和Her2胞外段-Fc融合蛋白的表达水平以及目的蛋白的生物素修饰效率.结果经PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序显示pAvi-BirA载体构建成功.Western印迹结果表明pAvi-BirA载体转染HEK293F细胞后,BirA酶在细胞中表达良好。在IIEK293F细胞中瞬时转染含有Her2胞外段-Fc基因片段的载体后,融合蛋白得到高效表达,并且能够有效进行生物素修饰。随着生物素添加剂量的增加,目的蛋白生物素修饰比例逐渐升高;当生物素母液(5mmol/L)添加剂量为2μl/ml时,蛋白生物素修饰水平不再提高.结论构建了生物素修饰蛋白真核表达载体,优化了生物素修饰蛋白制备方法,为相关领域科学研究提供了可靠的技术基础。 展开更多
关键词 BirA酶 avi-tag 生物素修饰蛋白 真核表达载体
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基于Avi-tag技术的双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白 被引量：1
2
作者 赵爽佳 鲍如梦 +3 位作者 唐海科 包雪翠 杨洪鸣 唐金宝 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期655-658,共4页
目的:利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。方法:PCR方式扩增EGFP基因片段,重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体pdi-Avitag,构建原核表达载体p EGFP-(Avitag)2并转化E-.coli DH5α;表达菌株... 目的:利用Avi-tag技术制备双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。方法:PCR方式扩增EGFP基因片段,重组至带有双Avi-tag标签的中间质粒载体pdi-Avitag,构建原核表达载体p EGFP-(Avitag)2并转化E-.coli DH5α;表达菌株菌体冻融上清经金属离子亲和色谱纯化目的蛋白EGFP-(Avitag)2,以Bir A酶体外催化生物素分子与目的蛋白在Avi-tag位点的生物连接,并以Western blot和竞争ELISA鉴定生物素化产物EGFP-B2的生物素化效果。结果:成功构建p EGFP-(Avitag)2载体,并在E.coli DH5α中可溶性表达EGFP-(Avitag)2,经Western blot和竞争ELISA鉴定,EGFP-(Avitag)2分子经Bir A酶体外催化可连接两个生物素分子。结论:成功获得双生物素分子位点专一性标记的增强型绿色荧光蛋白,为其在BAS体系中的应用奠定了研究基础。 展开更多
关键词 增强型绿色荧光蛋白 生物素化 avi-tag Bir A酶
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基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法 被引量：1
3
作者 李丹丹 李英 +3 位作者 吴小桃 鲁云霞 王学军 王升启 《生物技术通讯》 CAS 2011年第5期647-650,666,共5页
目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGF... 目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。 展开更多
关键词 avi-tag 增强型绿色荧光蛋白 BirA酶 人胚肾细胞 亲和纯化
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苏云金芽胞杆菌转录调控因子CodY的体外靶基因的筛选
4
作者 梅菲 齐明霞 李明顺 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期1178-1185,共8页
【目的】利用Avi-tag和Pulldown技术建立体外靶基因筛选的新方法,在苏云金芽胞杆菌YBT-1520基因组范围内进行体外高通量筛选转录调控因子CodY的靶基因,为深入研究CodY在苏云金芽胞杆菌中的功能及调控网络打下基础。【方法】用Avi-tag技... 【目的】利用Avi-tag和Pulldown技术建立体外靶基因筛选的新方法,在苏云金芽胞杆菌YBT-1520基因组范围内进行体外高通量筛选转录调控因子CodY的靶基因,为深入研究CodY在苏云金芽胞杆菌中的功能及调控网络打下基础。【方法】用Avi-tag技术对CodY蛋白进行体外生物素标记,酶切苏云金芽胞杆菌YBT-1520总DNA并在两端加上便于测序的adapter序列,用链霉亲和素树脂筛选与CodY蛋白相互作用的靶基因。【结果】在苏云金芽胞杆菌中得到了46条CodY可以直接作用的靶序列,分析发现CodY在苏云金芽胞杆菌中主要调控氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢、转运、调控、DNA修复、双组份调控等的转录。【结论】本研究采用的Avi-tag技术具有特异性强、操作简单、成本低等优势,为转录因子体外靶序列的高通量筛选提供新的方法;苏云金芽胞杆菌中CodY靶基因的筛选为其他微生物中CodY的功能研究打下基础。 展开更多
关键词 CodY 靶基因 avi-tag技术 苏云金芽胞杆菌 生物素 调控
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