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中华按蚊谷胱甘肽-S-转移酶E6(AsGSTE6)的表达纯化与结晶 被引量：2
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作者 苗娅 张甜甜 +1 位作者 许柏英 陈斌 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期59-67,共9页
【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ... 【目的】对中华按蚊Anopheles sinensis谷胱甘肽-S-转移酶E6(As GSTE6)进行初步晶体学研究,为深入研究其空间结构奠定基础。【方法】利用生物信息学软件,首先对中华按蚊As GSTE6进行生物信息学预测和分析;然后进行分子克隆,构建重组子p ET28a-As GSTe6;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达系统进行诱导表达;采用Ni-NTA金属螯合层析和葡聚糖凝胶层析的方法对重组蛋白进行纯化;通过葡聚糖凝胶层析和化学交联的结果分析蛋白的聚合状态;运用坐滴蒸气扩散法对重组蛋白进行结晶筛选。【结果】生物信息学分析结果表明,As GSTE6分子量为25.28 k D,无信号肽和跨膜区,是亲水性蛋白;三级结构预测结果显示,As GSTE6主要由一个小的βαβαββα折叠模式的N端结构域和一个大的全螺旋的C端结构域组成。多重序列比对结果表明,在不同昆虫中GSTE6具有高度保守性。分子克隆得到中华按蚊As GSTE6的编码基因As GSTe6序列,大小为672 bp。在大肠杆菌中As GSTE6主要在上清中有大量表达,为可溶性表达;通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析纯化出了高纯度且稳定的As GSTE6重组蛋白;凝胶过滤层析结合化学交联的结果证实体外纯化的融合蛋白As GSTE6主要呈二聚体状态;通过晶体筛选获得了As GSTE6的晶体。【结论】运用结晶学的方法获得了As GSTE6的晶体,这为后续解析As GSTE6的三维结构奠定了基础。 展开更多
关键词 中华按蚊 谷胱甘肽-S-转移酶 asgste6 原核表达 纯化 结晶
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