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结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫 被引量：22
1
作者 范雄林 徐志凯 +4 位作者 李元 薛莹 张芳琳 李别虎 白光春 《第四军医大学学报》 北大核心 2001年第14期1282-1286,共5页
目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RN... 目的　研究已构建的编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) H37Ra株 Ag85 B成熟蛋白基因的真核表达质粒 p TB30 m的表达和免疫原性 .方法　以电穿孔法将 p TB30 m转染 CHO细胞 ,RT- PCR法检测转染细胞中 Ag85 B特异的 m RNA的表达 .将 p TB30 m质粒肌注免疫 BAL B/c和 C5 7BL /6小鼠 ,EL ISA法检测基因免疫的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,生物学方法检测 IFNγ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 RT- PCR检测证实 p TB30 m可在 CHO细胞中表达 .p TB30 m免疫小鼠可引起较高水平的 Ag85 B特异性的抗体应答 .免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞增殖显著 ,BAL B/c和 C5 7BL/6小鼠 IFNγ的量分别达到 136 0 ng· L- 1 和 196 5 ng· L- 1 ,而生理盐水和空质粒对照组均低于 80 ng· L- 1 .结论　应进一步研究 p TB30 m作为TB的基因疫苗用于 TB的防治的效果 . 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 DNA疫苗 免疫原性 ag85b
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结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达 被引量：13
2
作者 江山 朱道银 +2 位作者 蒋英 骆旭东 陈全 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第21期1973-1975,共3页
目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达... 目的 :构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 .方法 :采用 geneSOE ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3 行PCR扩增融合 ,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1 (+)中构建真核表达质粒 pCDAg85B A ,酶切、DNA测序鉴定 ,用脂质体法将 pCDAg85B A转染COS 7细胞 ,采用RT PCR ,ELISA方法检测其表达 .结果 :Ag85B Ag85A融合基因定向克隆入pcDNA3.1 (+) ,双向测序表明碱基无突变 ,Ag85B Ag85A融合基因在真核细胞中能表达 .结论 :成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ag85b ag85A 融合基因 双抗原融合真核表达质粒 基因表达
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结核分枝杆菌DNA疫苗对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究 被引量：18
3
作者 江山 朱道银 +2 位作者 骆旭东 蒋英 陈全 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期305-309,共5页
目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组... 目的探讨结核分枝杆菌DNA疫苗pcD85B、pcDMPT64以及小鼠白细胞介素12(IL-12)真核表达质粒psIL12对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠100只随机分成生理盐水对照组、pcDNA3.1对照组,psIL12治疗组,pcD85B、pcDMPT64、pcD85B+pcDMPT64、pcD85B+psIL12DNA疫苗治疗组。感染4周后分别给予生理盐水、空质粒、psIL-12及DNA疫苗,第1次治疗后2个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞特异性γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌水平,并于第1次治疗后2个月、5个月观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果pcD85B治疗组肺组织荷菌量(lg-1CFU/g)为6.99±0.40,比生理盐水对照组(8.15±0.37)、pCDNA3.1对照组(8.19±0.29)显著降低(P<0.01);脾组织荷菌量(lg-1CFU/g,x±s)为5.17±0.33,比生理盐水对照组(5.76±0.16)及空质粒对照组(5.88±0.21)显著降低(P<0.05)。psIL12治疗组的肺(7.41±0.50)、脾(5.31±0.21)荷菌量比对照组显著降低(P<0.05);pcD85B+psIL12治疗组肺、脾荷菌量与pcD85B组比较差别无统计学意义。pcD85B组脾淋巴细胞IFN-γ、TNFα水平比对照组显著升高(P<0.05),各组间IL4水平差异无统计学意义。生理盐水对照组、pCDNA3.1对照组肺组织? 展开更多
关键词 免疫治疗作用 DNA疫苗 结核病 肿瘤坏死因子α(TNF-α) 小鼠 实验研究 PCDNA3.1 结核分枝杆菌感染 PCDNA3.1 IFN-γ ag85b 肺组织病理改变 生理盐水 白细胞介素 真核表达质粒 对照组 治疗组 细胞特异性 脾淋巴细胞 纤维母细胞
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结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建 被引量：11
4
作者 范雄林 徐志凯 +3 位作者 白光春 李元 李别虎 薛莹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期314-316,共3页
目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,... 目的构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B基因为基础的核酸疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Ra株基因组中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因 ,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体 pUC19中。经酶切鉴定与序列测定证实后 ,以亚克隆法构建于真核表达载体 pcDNA3的相应酶切位点。结果结核分枝杆菌H37Ra株Ag85B成熟蛋白的编码基因经序列测定证实 ,与Erdman株完全一致 ;用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定证实 ,克隆基因正确插入载体pcDNA3。结论以Ag85B成熟蛋白的编码基因为基础的真核表达载体的构建成功 ,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ag85b 真核表达载体 基因克隆
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结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及其保护力 被引量：11
5
作者 师长宏 范雄林 +3 位作者 柏银兰 薛莹 张海 徐志凯 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第18期1633-1636,共4页
目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrat... 目的 :研究Ag85B与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对MTB感染小鼠的保护力 .方法 :采用皮下包埋的方法 ,将预先转移到硝酸纤维素膜上的表达蛋白免疫小鼠 3次 ,每次间隔 2wk,用MTB培养上清滤液蛋白 (culturefiltrateproteins,CFP)作为抗原 ,ELASA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度 .为了检测融合蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答 ,最后一次免疫完成后 4wk ,取一部分免疫小鼠分离脾淋巴细胞 ,体外用抗原刺激 ,MTT法检测淋巴细胞刺激反应 ,ELISA检测悬液中IFN γ水平 .另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv ,4wk后计数脾脏细菌负荷数 .结果 :Ag85B ESAT6蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶10 0 0 ,ESAT6 Ag85B蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶5 0 0 0 .融合蛋白Ag85B ESAT6和ESAT6 Ag85B免疫组淋巴细胞刺增殖指数分别为 2 .4 0± 0 .17和 2 .6 0± 0 .2 5 ,而生理盐水组只有 0 .90± 0 .2 1;相对应的IFN γ含量分别为 (3.5 1± 0 .30 ) μg/L和 (4 .0 5± 0 .4 1) μg/L ,显著高与生理盐水对照组 (0 .5 0± 0 .2 5 ) μg/L ,P <0 .0 5 ,但不及BCG免疫组 (5 .5 5±0 .31) μg/L .与生理盐水免疫组 (细菌负荷6 .31± 0 .13)相比较 ,融合蛋白免疫的BALB/c小鼠 。 展开更多
关键词 分支杆菌 结核 疫苗 抗原85b ESAT6 重组融合蛋白质类
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结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究 被引量：13
6
作者 张真 赵玲娜 +3 位作者 申梦 王希良 杨鹏辉 包金风 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期109-115,共7页
目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒... 目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。 展开更多
关键词 DNA疫苗 ag85b ESAT6 HSP65 分枝杆菌
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结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究 被引量：8
7
作者 范雄林 徐志凯 +5 位作者 李元 李别虎 薛莹 柏银兰 白光春 贾向志 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期90-92,共3页
目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱... 目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ag85b 基因疫苗 免疫保护作用
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融合表达Ag85B-ESAT6的结核分枝杆菌真核表达载体的构建及其免疫原性 被引量：6
8
作者 师长宏 范雄林 +3 位作者 徐志凯 李元 柏银兰 薛莹 《第四军医大学学报》 北大核心 2004年第2期121-124,共4页
目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从... 目的 :构建融合表达结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB)分泌蛋白Ag85B ESAT6真核表达载体 ,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力 .方法 :设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物 ,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段 ,将片段分别与pGEM T easy载体连接后测序 .将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆 ,分别命名为AZ pcD NA3 EF 和EZ pcDNA3 AF,将重组质粒电转CHO细胞 ,RT PCR检测融合蛋白mRNA的表达 ,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达 ;用重组质粒免疫BALB/c小鼠 ,ELISA测定特异性抗体的滴度 .结果 :PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致 .RT PCR可检测融合基因转录出mR NA ,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光 ,AZ pcD NA3 EF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 0 0 0 ,EZ pcD NA3 AF 质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为 1∶1 5 0 0 .结论 :Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功 。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 ag$5b ESAT6 融合表达 遗传载体
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察 被引量：5
9
作者 骆旭东 朱道银 +2 位作者 陈全 蒋英 江山 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期592-594,共3页
目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.... 目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ag85b MPT64 融合基因 DNA疫苗
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结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究 被引量：6
10
作者 刘建利 师长宏 +3 位作者 靳亚平 张海 赵勇 赵雷 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期449-452,共4页
目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的... 目的将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究。方法采用PCR方法从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。将测序正确的目的基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α。经IPTG诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定。通过镍柱对融合蛋白进行纯化。在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定。结果PCR法扩增获得的各目的基因片段与GenBank报道的一致。构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达。融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应。该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应。结论结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础。 展开更多
关键词 ag85b ESAT6 柔性链 融合蛋白 原核表达 纯化
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Ag85A和Ag85B DNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果 被引量：5
11
作者 刘晶 韩国梁 +3 位作者 杨晓峰 田平贵 王鹏 张晓俊 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2008年第2期144-149,共6页
目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫... 目的:探讨Ag85A和Ag85BDNA疫苗对大鼠膀胱癌免疫治疗的效果。方法:致癌剂N-甲基亚硝基脲(methyl nitrosourea,MNU)膀胱灌注雌性Wistar大鼠制备膀胱癌模型。将建模成功的48只大鼠随机分为生理盐水组、空白质粒组、卡介苗组、Ag85A DNA疫苗组、Ag85B DNA疫苗组、Ag85A+Ag85B DNA疫苗组(每组各8只),建模后第7、14、21天于大鼠右后肢肌内注射相应药物。第28天处死大鼠,流式细胞仪检测各组大鼠脾脏细胞的CD4+和CD8+T细胞亚群数量并计算CD4+/CD8+比值;ELISA法检测大鼠血清中IFN-γ分泌水平;剥离膀胱肿瘤进行组织病理学检查。结果:成功建立大鼠膀胱癌模型,致瘤率100%。经疫苗治疗后,Ag85A组、Ag85B组和Ag85A+Ag85B组膀胱肿瘤体积均有所减小、病理分级也有所减轻,但效果不及卡介苗组。Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组和卡介苗组CD4+T细胞亚群数量分别为(17.27±2.95)%、(23.15±1.56)%、(30.80±1.83)%、(38.05±1.48)%;CD8+ T细胞亚群数量分别为(9.03±1.06)%、(10.28±0.39)、(11.29±0.74)、(13.14±1.24);CD4+/CD8+比值分别为(1.90±0.10)、(2.25±0.08)、(2.73±0.19)、(2.97±0.23);血清IFN-γ含量分别为(96.94±12.38)、(131.03±26.68)、(179.20±28.88)、(240.53±32.17)pg/ml;与生理盐水、空白质粒组相比,Ag85A组、Ag85B组、Ag85A+Ag85B组能够显著提高以上4项检测指标(P<0.01),但均低于卡介苗组;Ag85A+Ag85B组效果强于Ag85B组、更强于Ag85A组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:应用Ag85A和Ag85BDNA疫苗均可提高膀胱癌大鼠的免疫功能,其效果为Ag85A+Ag85B>Ag85B>Ag85A,但总体上都达不到卡介苗的抗癌免疫效果。 展开更多
关键词 膀胱癌 DNA疫苗 ag85A ag85b 卡介苗
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结核分支杆菌Ag85B DNA疫苗的构建及其免疫作用的研究 被引量：9
12
作者 游力 赵跃然 +4 位作者 高春义 张建 冯进波 许晓群 田志刚 《中华结核和呼吸杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第12期736-739,共4页
目的　研究pcDNA3 Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法　将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中 ,制备pcDNA3 Ag85BDNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3 Ag85B免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠抗Ag85B抗体水... 目的　研究pcDNA3 Ag85B质粒DNA疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的作用。方法　将结核分支杆菌Ag85B基因插入载体pcDNA3中 ,制备pcDNA3 Ag85BDNA疫苗。分别以生理盐水、pcDNA3及pcDNA3 Ag85B免疫BALB/c小鼠 ,检测小鼠抗Ag85B抗体水平 (ELISA)和体外特异抗原刺激诱导的免疫小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10、IFN γ表达水平。结果　pcDNA3 Ag85B诱生的抗Ag85B效价明显高于生理盐水组和pcDNA3组 ;pcDNA3 Ag85B免疫小鼠脾细胞在Ag85B抗原刺激下 ,IL 2和IFN γmRNA转录水平明显高于对照组 ,而IL 4和IL 10mRNA转录水平在 3组中无明显变化。结论　pcDNA3 Ag85B质粒DNA疫苗不仅能增强体液免疫 。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 DNA疫苗 免疫原性 ag85b 抗原 抗结核菌苗
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结核分枝杆菌Rv1886c蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备 被引量：7
13
作者 刘琼 李慧 +3 位作者 罗鹏征 马国荣 张炜 万巧凤 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期63-67,73,共6页
目的表达、纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv1886c重组蛋白(Ag85B),并免疫小鼠制备多克隆抗体。方法采用PCR技术从M.tb(H37Rv)基因组中扩增Rv1886c基因,克隆至pET-28a质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-Rv1886c,转化E... 目的表达、纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv1886c重组蛋白(Ag85B),并免疫小鼠制备多克隆抗体。方法采用PCR技术从M.tb(H37Rv)基因组中扩增Rv1886c基因,克隆至pET-28a质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-Rv1886c,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达Ag85B蛋白,并对表达条件进行优化。采用Ni-NTA His亲和层析柱纯化目的蛋白;将纯化的蛋白经皮下注射BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,ELISA法检测抗体滴度,Western blot法检测抗体特异性。结果重组表达质粒pET-28a-Rv1886c经双酶切和测序鉴定证明构建正确;重组蛋白的最适表达条件为0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达4 h,获得了相对分子质量约30000的重组蛋白;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,蛋白浓度约为1.5 mg/mL;免疫BALB/c小鼠后获得的抗Ag85B血清具有良好的抗原结合特性,且抗体滴度达1︰51200。结论成功获得了高纯度的Rv1886c蛋白Ag85B,并制备了小鼠抗Ag85B多克隆抗体,为进一步研究TB的血清学早期诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Rv1886c基因 ag85b 原核表达 多克隆抗体
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结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗的免疫原性比较 被引量：6
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作者 骆旭东 朱道银 +2 位作者 陈全 蒋英 江山 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第17期1630-1631,共2页
目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因... 目的 :研究并比较结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B和MPT6 4DNA疫苗免疫学特性 .方法 :雌性C5 7/6小鼠 2 0只 ,随机分为 4组 .A组 (PBS)、B组 (pcDNA3.1)、C组 (pcDNA/Ag85B)、D组 (pcDNA/MPT6 4 ) ;分别于胫前肌注射 7.5g·L-1利多卡因和质粒混合物 (1∶4 ,5 0 μL) ,含质粒 70 μg/次 ,末次免疫后 4wk收集血清测总IgG ,分离脾淋巴细胞用PPD刺激后分别作脾淋巴细胞增殖实验 (MTT法 )和测上清中IFN γ 含量 .结果 :Ag85B和MPT6 4基因疫苗均能诱导小鼠产生特异性的IgG(平均滴度为 1∶80和 1∶6 0 )、脾淋巴细胞增殖 (比值≥ 2 )和IFN γ 的分泌 (Ag85B 176 2ng·L-1;MPT6 4 15 2 3ng·L-1) ,其淋巴细胞增殖和IFN γ 的分泌水平 ,Ag85B优于MPT6 4 .结论 :Ag85B和MPT6 4DNA疫苗均能诱导小鼠产生特异性细胞免疫和体液免疫 . 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 ag85b MPT64 DNA疫苗
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T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节 被引量：7
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作者 陈丽萍 张荣波 +5 位作者 胡东 吴静 张金凤 吴汉霞 李昕 牛凯 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期680-683,共4页
目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法... 目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。 展开更多
关键词 T—bet ag85b 疫苗 结核 免疫调节
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牛分枝杆菌Ag85B的生物信息学分析及多表位候选抗原的构建
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作者 董希望 张岩 +4 位作者 魏稚彤 李文欣 刘思宇 梁栋 赵海涛 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第15期62-65,72,118,119,共7页
为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的... 为了构建基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,试验采用生物信息学方法对Ag85B蛋白的理化性质、亲/疏水性、二级结构等进行分析,预测其T、B淋巴细胞抗原表位,并构建以pET-28a(+)为载体的多表位候选抗原,分析预测多表位候选抗原的理化性质、抗原性并进行免疫模拟。结果表明:Ag85B蛋白有325个氨基酸残基,相对分子量为34.58085,理论等电点为5.62,脂肪系数为72.18,亚细胞定位于线粒体、细胞质和高尔基体中,具有亲水性、信号肽和跨膜结构域,属于分泌型蛋白,其无规则卷曲和β-转角结构的占比分别28.15%和8.62%,含有3个T淋巴细胞优势表位和8个B淋巴细胞优势表位。构建的Ag85B多表位候选抗原为亲水性蛋白和非致敏原,两次预测免疫原性参数分别为0.893和1.524,可诱导特异性的体液和细胞免疫应答。说明试验成功构建出基于牛分枝杆菌Ag85B蛋白的多表位候选抗原,且该多表位候选抗原可能诱导机体产生T、B淋巴细胞免疫应答。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌 抗原表位 ag85b 生物信息学 多表位候选抗原
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结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达 被引量：5
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作者 骆旭东 陈全 +2 位作者 蒋英 江山 朱道银 《第四军医大学学报》 北大核心 2003年第12期1088-1090,共3页
目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/A... 目的 :构建结核分枝杆菌 (H37Rv)Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 .方法 :采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT6 4编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser) 3经PCR扩增融合 ,定向克隆入 pcDNA3.1(+)中 .采用脂质体转染法将pcDNA/Ag85B MPT6 4 (pcDNA/AM )转染COS 7细胞 ,用RT PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达 .结果 :Ag85B MPT6 4融合基因经双向DNA序列测定 ,碱基突变率为 0 .11%(2 /170 7) ,突变为无意义突变 ;重组质粒转染COS 7细胞后经检测证实 ,该融合基因能在真核细胞中表达 .结论 :成功地构建了Ag85B MPT6 4融合基因并在真核细胞中表达 。 展开更多
关键词 分枝杆菌 结核 ag85b MPT64 重组融合蛋白质类
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结核分枝杆菌Ag85B-mRNA疫苗的体外合成及其免疫原性研究 被引量：6
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作者 夏敏 杨晓岚 +1 位作者 杨鹏辉 王希良 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期404-408,共5页
目的体外转录结核分枝杆菌Ag85B-mRNA并评价其免疫原性。方法结合密码子偏好性、GC含量和mRNA二级结构的自由能,优化Ag85B编码区序列,并在其两端插入β球蛋白3’和5’UTR序列。合成目的序列,进行体外转录。经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确,体... 目的体外转录结核分枝杆菌Ag85B-mRNA并评价其免疫原性。方法结合密码子偏好性、GC含量和mRNA二级结构的自由能,优化Ag85B编码区序列,并在其两端插入β球蛋白3’和5’UTR序列。合成目的序列,进行体外转录。经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确,体外转染细胞验证其表达后,联合鱼精蛋白免疫Balb/c小鼠,检测特异性细胞免疫应答。结果 Ag85B优化序列二级结构分析显示,其具有更高的稳定性。成功体外合成稳定的Ag85B-mRNA。Western blot检测Ag85B-mRNA转染293T细胞24、48 h,均有清晰特异性的目的蛋白条带。小鼠免疫试验结果显示,Ag85B-mRNA可诱导针对结核分枝杆菌Ag85B分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答。结论成功体外合成稳定的Ag85B-mRNA疫苗,具有较好的免疫原性,为新型结核疫苗的研制提供新思路。 展开更多
关键词 ag85b mRNA疫苗 序列设计 免疫评价
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融合蛋白RAP的免疫原性分析
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作者 刘新矿 王鑫鑫 王晓春 《安徽理工大学学报（自然科学版）》 CAS 2024年第3期101-108,共8页
目的结核病(Tuberculosis,TB)目前是全球单一感染源造成死亡的主要原因之一,且广泛接种的卡介苗对于不同人的效果不一且有一定的副作用,甚至在某些成年人身上效果甚微,为了获得效果更好、安全性更好的结核疫苗对融合蛋白RAP进行了分析... 目的结核病(Tuberculosis,TB)目前是全球单一感染源造成死亡的主要原因之一,且广泛接种的卡介苗对于不同人的效果不一且有一定的副作用,甚至在某些成年人身上效果甚微,为了获得效果更好、安全性更好的结核疫苗对融合蛋白RAP进行了分析验证。方法将融合蛋白RAP连接到pET30b原核表达载体上通过双酶切鉴定构建重组质粒、用热休克法和诱导剂诱导蛋白表并通过Ni-NTA纯化蛋白;全血干扰素释放测定法(WBIA)检测RAP刺激的人外周血中IFN-γ的水平;ELISA法检测小鼠特异性IgG、IgG1和IgG2a以及IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4的分泌水平。结果成功构建pET30b-RAP重组质粒并表达纯化RAP蛋白;RAP及其各组成蛋白能明显导致国内M.tb感染者分泌高水平的IFN-γ;小鼠经过RAP/MTO免疫后会发生Th1型反应产生特异性高滴度IgG抗体且使抗原特异性Th1型细胞因子分泌能力明显增强。结论根据得到的实验结果推断出RAP具有强大且特异性的免疫能力,所以有希望成为一种有前景的结核病候选疫苗。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 Rv0577 ag85b PPE18 结核疫苗
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Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫对可移植性鼠膀胱肿瘤的免疫调节效应 被引量：2
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作者 杨晓峰 张晓俊 王鹏 《现代泌尿外科杂志》 CAS 2009年第1期8-11,共4页
目的探讨联合应用Ag85A与Ag85B DNA疫苗抗膀胱肿瘤的免疫效应。方法采用小鼠膀胱癌BTT739细胞株,构建可移植性T739小鼠膀胱肿瘤模型。随机法分为6组:生理盐水组、BCG组、pcDNA3.1+组、pcDNA-Ag85A组、pcDNA-Ag85B组及pcDNA-Ag85A和pcDNA... 目的探讨联合应用Ag85A与Ag85B DNA疫苗抗膀胱肿瘤的免疫效应。方法采用小鼠膀胱癌BTT739细胞株,构建可移植性T739小鼠膀胱肿瘤模型。随机法分为6组:生理盐水组、BCG组、pcDNA3.1+组、pcDNA-Ag85A组、pcDNA-Ag85B组及pcDNA-Ag85A和pcDNA-Ag85B联合组。荷瘤后第7天、14天和21天各肌注1次,末次注射后第7天检测各组小鼠脾脏的CD4+和CD8+T细胞亚群数量及CD4+/CD8+比值、小鼠血清IFN-γ、肿瘤体积重量并进行组织病理学检查。结果Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫组CD4+和CD8+T细胞亚群数量及CD4+/CD8+比值、血清IFN-γ明显高于DNA疫苗单独免疫组;小鼠的肿瘤重量明显低于DNA疫苗单独免疫组,差异有显著性(P<0.05);肿瘤组织病理学分析Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫组肿瘤坏死较DNA疫苗单独免疫组明显,且瘤体周围及瘤体内炎性细胞浸润较多。但Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合、pcDNA-Ag85A、pcDNA-Ag85B DNA疫苗单独应用组均不及单纯应用BCG的免疫调节效应。结论Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫在抗膀胱肿瘤过程中具有明显的免疫效应,明显优于DNA疫苗单独免疫,二者联用具有协同增强免疫效应;但Ag85A与Ag85B DNA疫苗联合免疫效应尚达不到BCG的作用。 展开更多
关键词 膀胱癌 卡介苗 DNA疫苗 ag85A ag85b
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