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一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立 被引量：129
1
作者 张驰宇 徐顺高 黄新祥 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第9期883-888,共6页
为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成... 为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法. 展开更多
关键词 荧光实时定量RT-PCR 相对定量 绝对定量 标准曲线 mRNA定量 斜率
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荧光定量PCR数据处理方法的探讨 被引量：79
2
作者 唐永凯 贾永义 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第3期89-91,共3页
realtime RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量方... realtime RT-PCR通过直接检测指数扩增期的PCR产物来确定基因的初始模板量,是定量基因表达最灵敏的方法,其准确性取决于扩增效率以及数据的处理方法。目前最常用的两种分析荧光定量PCR实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量方法是通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较处理过的样品和未处理过的样品目的基因之间的表达差异。而相对定量又有双标准曲线法,2-△△Ct法以及动力学法。该文介绍了这些方法的推导、假设及其应用。 展开更多
关键词 荧光定量PCR 绝对定量 相对定量
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基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展 被引量：50
3
作者 李亮 隋志伟 +2 位作者 王晶 臧超 余笑波 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1017-1023,共7页
数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术.该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数.DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定... 数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术.该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数.DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素.本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景. 展开更多
关键词 数字PCR 绝对定量 实时荧光定量PCR 拷贝数 单分子
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数字PCR技术及其应用进展 被引量：27
4
作者 冯兆民 舒跃龙 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期103-107,共5页
数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定... 数字PCR(Digital PCR,dPCR)是核酸绝对定量的新方法,该技术通过分液,将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增,根据荧光信号的有或无,进行结果计数,通过泊松分布的统计处理,直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR(Quantitative PCR,qPCR),dPCR不需要建立标准曲线,应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。 展开更多
关键词 数字PCR 绝对定量 拷贝数 实时荧光定量PCR
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数字PCR技术及应用研究进展 被引量：26
5
作者 林佳琪 苏国成 +1 位作者 苏文金 周常义 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期170-177,共8页
数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室,PCR扩增反应后,对荧光信号进行检测分析,实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖,具有更高灵敏度和准确度,在... 数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室,PCR扩增反应后,对荧光信号进行检测分析,实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖,具有更高灵敏度和准确度,在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法,并评述该技术在主要应用领域的研究进展。 展开更多
关键词 数字PCR 绝对定量 泊松分布 突变检测 拷贝数变异检测 微生物检测 转基因食品检测
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数字聚合酶链式反应技术在食品安全检测领域的研究应用进展 被引量：23
6
作者 刘津 刘二龙 +3 位作者 谢力 李志勇 相大鹏 高东微 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2016年第17期275-280,共6页
数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食... 数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)作为一项新兴的基于单分子目标基因扩增的绝对定量技术,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文综述了商业化dPCR技术在转基因成分、动物源性成分、食源性致病微生物定量检测等食品安全领域的研究进展,讨论了dPCR应用中技术难题的解决,并在此基础上展望了该技术在食品安全检测领域的发展前景。 展开更多
关键词 数字聚合酶链式反应 食品安全 绝对定量 检测
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微滴式数字PCR技术用于生物样品种属鉴定和绝对定量 被引量：23
7
作者 胡伟 陈荣华 +3 位作者 张晨 安志远 王斌 平原 《法医学杂志》 CAS CSCD 2014年第5期342-345,共4页
目的运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量。方法选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释。使用微滴式... 目的运用微滴式数字PCR技术进行生物样品的种属鉴定和绝对定量。方法选择人mtDNA两个编码基因ND4和16S rRNA,设计特异性引物与探针,用人来源及常见动物样本验证种属特异性,再用重组质粒和2组共16份人来源生物检材,倍比稀释。使用微滴式数字PCR技术进行种属检验和绝对定量,验证其灵敏度和稳定性。结果人重组质粒FAM(ND4)可进行人来源样品的检测,其检测结果与各级稀释梯度基本吻合,微滴式数字PCR技术可以检测出反应体系中低至单拷贝的DNA。结论微滴式数字PCR技术可以进行生物样品的种属鉴定和绝对定量,并具有很高的灵敏度和特异性,可应用于日常法医物证检验。 展开更多
关键词 法医遗传学 聚合酶链反应 种属鉴定 绝对定量 微滴式数字PCR
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实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究 被引量：16
8
作者 蔡刚 李闻捷 沈茜 《上海医学检验杂志》 北大核心 2003年第6期343-346,共4页
目的　探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法　建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果　优化条件后 ,R... 目的　探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法　建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果　优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论　为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。 展开更多
关键词 实时逆转录-聚合酶链反应 绝对定量 实验 优化 研究
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数字PCR技术及其在检测领域的应用 被引量：20
9
作者 冯秀晶 易红梅 +3 位作者 任星旭 任佳丽 葛建镕 王凤格 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期363-373,共11页
随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化,用于核酸检测的各种PCR衍生技术应运而生。数字PCR是一种单分子水平的大规模分区扩增定量核酸检测技术。该技术以微腔室/微孔或微滴作为PCR反应器,无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品... 随着分子生物学技术的不断发展和需求的多样化,用于核酸检测的各种PCR衍生技术应运而生。数字PCR是一种单分子水平的大规模分区扩增定量核酸检测技术。该技术以微腔室/微孔或微滴作为PCR反应器,无需校准物和绘制标准曲线即可实现对样品初始浓度的绝对定量,具有高灵敏度、高特异性和高精确度的特点。本文详细介绍了数字PCR的技术发展史、作用原理以及仪器平台类型,系统阐述了数字PCR在转基因检测、疾病诊断、环境及食品监管等方面的应用概况,并对该技术的应用前景进行了展望,以期对未来数字PCR的开发利用提供参考。 展开更多
关键词 数字PCR 单分子 绝对定量
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一种可绝对定量核酸的数字PCR微流控芯片 被引量：17
10
作者 朱强远 杨文秀 +6 位作者 高一博 于丙文 邱琳 周超 金伟 金钦汉 牟颖 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2013年第3期545-550,共6页
构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片.应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片.芯片的大小与... 构建了一种新型的可进行核酸单分子扩增和核酸绝对定量的数字聚合酶链式反应(数字PCR)微流控芯片.应用多层软光刻技术,以聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为芯片材料,盖玻片作为基底制作了具有3层结构以及微阀控制功能的微流控芯片.芯片的大小与载玻片相当,可同时检测4个样品,每个样品通入芯片后平均分配到640个反应小室,每个小室的体积为6 nL.以从肺癌细胞A549中提取的18sRNA为样品检测了该芯片的可行性.将样品稀释数倍后通入芯片,核酸分子随机分布在640个小室中并扩增.核酸分子在芯片中的分布符合泊松分布原理,当样品中待测核酸分子平均拷贝数低于0.5个/小室时,则每个反应小室包含0个或1个分子.经过PCR扩增后,有模板分子的小室检测结果为阳性反应,而无模板分子的小室为阴性反应,最后通过计数阳性反应室的个数,可绝对定量原始待测样品中的目标DNA分子拷贝数.实验结果表明,该数字PCR芯片可实现DNA单分子反应和核酸绝对定量,具有成本低、灵敏度高、节省时间和试剂以及操作简单等优点,为数字PCR方法在普通实验室的应用提供了一种新途径,可用于癌症及感染性疾病的早期诊断、单细胞分析、产前诊断以及各种细菌病毒的核酸检验等研究. 展开更多
关键词 数字聚合酶链式反应 微流控芯片 单分子扩增 核酸定量 绝对定量
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数字PCR技术的发展及应用 被引量：17
11
作者 李慧调 潘建章 方群 《化学进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2020年第5期581-593,共13页
数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定... 数字PCR(Digital PCR, dPCR)是继实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。 展开更多
关键词 微流控技术 数字PCR 绝对定量
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数字PCR技术在动物疫病诊断中的应用进展 被引量：15
12
作者 郭宏伟 赵绪永 +3 位作者 李华玮 张震 马辉 郑鸣 《动物医学进展》 北大核心 2021年第2期102-106,共5页
数字PCR技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术,与实时荧光定量PCR技术相比,该技术敏感性更高、定量不依赖于标准曲线、对反应抑制物的耐受能力也更高。目前,该技术在转基因检测、物种鉴定、疾病诊断、病原微生物鉴定和精确定量分... 数字PCR技术是一种能够进行绝对定量的核酸检测技术,与实时荧光定量PCR技术相比,该技术敏感性更高、定量不依赖于标准曲线、对反应抑制物的耐受能力也更高。目前,该技术在转基因检测、物种鉴定、疾病诊断、病原微生物鉴定和精确定量分析等领域具有较广阔的应用前景。论文对数字PCR的发展历史、原理、优缺点及在动物疫病诊断中的应用进行了综述,以期为提高动物疫病诊断能力的提供借鉴。 展开更多
关键词 数字聚合酶链反应 绝对定量 动物疫病诊断 实时荧光定量聚合酶链反应
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微滴式数字聚合酶链式反应在食品安全检测领域的应用 被引量：15
13
作者 牛会敏 王静怡 +3 位作者 姚晓洁 魏华琳 陈万胜 邓迎春 《食品安全质量检测学报》 CAS 2020年第24期9295-9300,共6页
微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用... 微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新型核酸扩增技术,可对DNA或RNA分子采用绝对定量的方式进行分析。其结果具有更高的精准度、准确性和灵敏度,大大提升了数字PCR技术的可扩展性与实用性,促进了现代分子生物学在精准定量检测方面的发展和应用。本文重点论述了ddPCR法的技术原理、优势以及在食源性致病微生物定量检测、转基因成分分析、食品源性成分检测等食品安全检测领域的应用研究进展情况。 展开更多
关键词 微滴式数字聚合酶链式反应 绝对定量 食品安全检测
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实用WSSV定量检测方法的建立及其应用于脊尾白虾病毒感染规律的研究 被引量：14
14
作者 李新苍 周俊芳 +3 位作者 房文红 董建波 朱磊 王元 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1554-1562,共9页
为优化当前白斑综合征病毒(WSSV)定量检测方法,实验结合当前WSSV诊断与定量方法应用的实际,试图通过设计两对普通PCR引物来建立一种实用的WSSV绝对定量方法,并利用此方法进一步探明WSSV在脊尾白虾体内的增殖规律及致病性。首先根据WSSV... 为优化当前白斑综合征病毒(WSSV)定量检测方法,实验结合当前WSSV诊断与定量方法应用的实际,试图通过设计两对普通PCR引物来建立一种实用的WSSV绝对定量方法,并利用此方法进一步探明WSSV在脊尾白虾体内的增殖规律及致病性。首先根据WSSV的囊膜蛋白VP28基因序列设计了两对特异引物(F1,R1)和(RF2,RR2),分别用于标准品质粒的构建和扩增子的扩增,以开展SYBR Green染料法定量检测WSSV的研究;随后利用该定量检测方法分析了WSSV在脊尾白虾体内的组织分布及感染规律。研究结果显示:(1)以定量引物RF2和RR2建立的SYBR Green绝对定量检测方法具有敏感度高、特异性强、定量范围广且准确等特点;(2)WSSV能感染脊尾白虾鳃、肝胰腺、肌肉、头胸甲下结缔组织、胃及肠等组织,其中头胸甲下结缔组织病毒含量最高(1.1×107copies/μg),其次是鳃组织(4.1×106copies/μg);正常脊尾白虾感染WSSV,首先经过一个约48 h潜伏期,而后开始大量增殖并造成部分虾死亡,死亡率约为20%。 展开更多
关键词 脊尾白虾 白斑综合征病毒 检测与定量 感染规律
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基于威胁分析的信息系统风险评估方法 被引量：5
15
作者 张竞 薛质 林梦泉 《计算机工程》 CAS CSCD 北大核心 2004年第18期56-58,共3页
对信息系统风险评估的方法有多种,该文提出了基于威胁分析的量化风险评估方法。包括其评估的步骤、量化的不同实现方式——绝对量化方式和相对量化方式、两种量化方式的优缺点分析以及两种量化方式评估的举例说明。
关键词 信息系统 风险评估 绝对量化 相对量化
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数字PCR在转基因定量检测中的研究进展 被引量：10
16
作者 斯能武 李俊 +2 位作者 武玉花 吴刚 张丽 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期40-50,共11页
数字PCR对核酸分子进行定量检测时不依赖于标准曲线和标准物质,在转基因定量检测中可直接计算出模板中外源基因的拷贝数浓度值和转基因含量。本文概述了数字PCR在转基因定量检测中的应用,将数字PCR与实时荧光定量PCR的技术参数从检测特... 数字PCR对核酸分子进行定量检测时不依赖于标准曲线和标准物质,在转基因定量检测中可直接计算出模板中外源基因的拷贝数浓度值和转基因含量。本文概述了数字PCR在转基因定量检测中的应用,将数字PCR与实时荧光定量PCR的技术参数从检测特异性、线性动态范围、准确度、灵敏度、稳健性等方面进行了对比分析,以利其在转基因生物安全管理及转基因标识制度发挥技术支撑作用。本文还阐述了影响数字PCR检测结果的因素,探讨了数字PCR结果溯源至SI单位的可能性,为数字PCR在转基因定量检测以及其它领域核酸精确定量的应用提供参考。 展开更多
关键词 数字PCR 转基因生物 定量检测 绝对定量
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济阳坳陷牛庄洼陷南斜坡原油成熟度浅析 被引量：9
17
作者 李素梅 庞雄奇 +1 位作者 金之钓 黎茂稳 《地质地球化学》 CSCD 2002年第1期50-56,共7页
从定性和绝对定量角度对济阳坳陷牛庄洼陷南斜坡原油、烃源岩可溶物烃类组成进行了详细剖析 ,重点从定性和定量角度对该区“未熟 低熟油”的成熟度进行了讨论。结果表明 ,依据最新确认的未熟 低熟油界定标准 ,牛庄洼陷南斜坡八面河等... 从定性和绝对定量角度对济阳坳陷牛庄洼陷南斜坡原油、烃源岩可溶物烃类组成进行了详细剖析 ,重点从定性和定量角度对该区“未熟 低熟油”的成熟度进行了讨论。结果表明 ,依据最新确认的未熟 低熟油界定标准 ,牛庄洼陷南斜坡八面河等油田原油的定量成熟度参数已达到成熟油的范畴 ;标样定量分析表明 ,原油中粪甾烷、13α ,14α三环萜烷等热稳定性低的生物标志物绝对丰度极低 ;原油C2 9甾烷ααα2 0S/ (S +R)的实际值高于测定值 ,未熟 低熟烃类的混入是导致原油甾烷异构化参数值大幅度降低和热稳定性低化合物检出的根本原因。 展开更多
关键词 未熟-低熟油 混合油 成熟度 生物标志物 绝对定量 济阳坳陷 烃源岩
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基于窖泥微生物相对定量与绝对定量联用的窖泥老熟特征分析 被引量：9
18
作者 辜杨 项兴本 +4 位作者 王少磊 曹荣升 任聪 范文来 徐岩 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期3444-3457,共14页
【目的】基于传统的相对定量法,在总DNA提取过程中加入内标菌,探索不同老熟程度下窖泥微生物菌群组成特征。【方法】通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)作为内标菌,利用16S rRNA基因扩增子测序技术,基于相对丰度... 【目的】基于传统的相对定量法,在总DNA提取过程中加入内标菌,探索不同老熟程度下窖泥微生物菌群组成特征。【方法】通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)作为内标菌,利用16S rRNA基因扩增子测序技术,基于相对丰度与绝对丰度解析不同老熟程度窖泥内的菌群结构和理化差异。【结果】相对定量分析表明,随着窖泥老熟,窖泥微生物群落的多样性增加,己酸菌属(Caproiciproducens)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和互营单胞菌属(Syntrophomonas)等菌的相对丰度显著增高。结合绝对丰度分析,老熟窖泥内的生物量分别是新窖泥与趋老熟窖泥的600倍与28倍。不同于相对定量分析,乳杆菌属(Lactobacillus)的绝对丰度在老熟窖泥内并未降低,为新窖泥的20倍。己酸菌属在老窖泥中的绝对丰度为新窖泥的25000倍;其他功能微生物包括甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、互营单胞菌属的绝对丰度也随着窖龄的增加而显著增加。菌群结构的绝对定量动态分析表明,新窖泥转变为老熟窖泥的过程是一个菌群组成多样性不断提高、生物量也逐步增加的过程,老窖泥中己酸菌属、互营单胞菌属、多种甲烷菌等微生物绝对量的增加,推测对降低窖泥内的乳酸含量和形成窖泥稳态环境具有重要作用。【结论】绝对定量方法的引入,可观测不同窖龄窖泥微生物生物量的差异,解析不同老熟阶段窖泥功能微生物绝对丰度的动态变化,为窖泥菌群结构和代谢功能的定量化和因果关系研究提供了新的策略。 展开更多
关键词 浓香型白酒 窖泥 群落结构 定量
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坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：8
19
作者 王楠楠 刘芳 +5 位作者 许漩 张世伟 聂睿 殷冬冬 刘光清 王桂军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期15-19,共5页
为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲... 为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r2>0.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。 展开更多
关键词 鸭 坦布苏病毒 SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR E基因 绝对定量
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不同荧光定量PCR分析方法检测大鼠脑缺血再灌注损伤中Caspase-3基因的表达研究 被引量：7
20
作者 朱振洪 李金辉 万海同 《激光生物学报》 CAS CSCD 2011年第3期388-393,333,共7页
目的：应用实时荧光PCR检测大鼠脑缺血／再灌注损伤组织中的Caspase-3基因表达变化，并比较了相对定量与绝对定量分析方法的技术优劣。方法：相对定量实验中，以β—actin基因作为内参，采用Delta—delta Ct法计算目的基因表达变化。而... 目的：应用实时荧光PCR检测大鼠脑缺血／再灌注损伤组织中的Caspase-3基因表达变化，并比较了相对定量与绝对定量分析方法的技术优劣。方法：相对定量实验中，以β—actin基因作为内参，采用Delta—delta Ct法计算目的基因表达变化。而在绝对定量实验中，构建了含Caspase-3基因的重组质粒，以该重组质粒作标准品，构建标准曲线并计算样品组中Caspase-3基因拷贝数。结果：相对定量数据表明相对于假手术组，Caspase-3基因在模型组中的表达上调了7．52倍，而在治疗组1和2中分别上调了4．20倍和3．07倍。绝对定量实验结果表明假手术组Caspase-3基因拷贝数为1．42×10^5copies／μL，模型组中该基因为8．06×10’copies／ILL，基因上调了5．68倍，而治疗组1和2中该基因拷贝数分别为3．83×10^5 copics／μL和3．59×10^5 copies／μL，分别上调了2．71和2．52倍。结论：两种定量分析方法表明Caspase．3基因在模型组中和治疗组中变化趋势基本一致。绝对定量方法更精确，但需要标准品，所花费成本高。而相对定量方法虽然简便，但需要看家基因作为内参，存在一定误差，如何保证目的基因与内参基因扩增效率一致性是关健。 展开更多
关键词 荧光定量PCR 相对定量 绝对定量 CASPASE-3 脑缺血/再灌注
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