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pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体的构建及在PEG-PEI/Fe_3O_4纳米磁流体介导下转染肝癌细胞 被引量:4
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作者 贾萌 彭健 +4 位作者 周健 陈伟 赵劲风 潘一峰 张阳德 《郑州大学学报(医学版)》 CAS 北大核心 2008年第3期473-477,共5页
目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达。方法:PCR扩增AFP基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组... 目的:构建甲胎蛋白(AFP)启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组真核表达载体,并检测其在AFP阳性肝癌细胞株的特异性表达。方法:PCR扩增AFP基因启动子、HSV-TK基因,将上述片段插入EGFP-N1载体的多克隆位点,构建pEGFP-AFP-TK重组表达载体,通过包裹PEG-PEI/Fe3O4纳米磁流体,经其介导,转染AFP阳性肝癌细胞株HepG2和AFP阴性肝癌细胞株SMMC7721,利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法检测目的基因在2种细胞系中的表达。结果与结论:肝癌特异性真核表达载体pEGFP-AFP-TK构建成功。利用增强型绿色荧光蛋白及Western blotting法可以检测到嵌合AFP启动子的pEGFP-AFP-TK重组真核表达载体能够特异性在AFP阳性的肝癌细胞株表达,而在AFP阴性的肝癌细胞株中基本不表达。 展开更多
关键词 甲胎蛋白启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶 自杀基因 PEG—PEI/Fe3O4纳米磁流体
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载TK基因PEG-PEI Fe_3O_4纳米磁流体体外肿瘤细胞抑制的研究 被引量:3
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作者 薛敦 何剪太 +2 位作者 彭健 赵劲风 张阳德 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期332-334,共3页
目的:研究载TK基因PEG-PEIFe3O4纳米磁流体体外肿瘤细胞抑制特性。方法:以RT-PCR方法鉴定其在各细胞系中mRNA水平上的表达状况。采用MTT法研究载TK基因纳米颗粒体外抑制肿瘤细胞的生长作用。结果:PEG-PEIFe3O4纳米磁流体能有效的转染pAF... 目的:研究载TK基因PEG-PEIFe3O4纳米磁流体体外肿瘤细胞抑制特性。方法:以RT-PCR方法鉴定其在各细胞系中mRNA水平上的表达状况。采用MTT法研究载TK基因纳米颗粒体外抑制肿瘤细胞的生长作用。结果:PEG-PEIFe3O4纳米磁流体能有效的转染pAFP-TK进入AFP阳性的HepG2细胞,并在细胞内得以正常表达。MTT法显示,AFP阳性的细胞在转染pAFP-TK后对GCV的敏感性大大提高,细胞存活率明显下降。结论:PEG-PEIFe3O4纳米磁流体能高效转染pAFP-TK质粒进入细胞,并在AFP阳性肝癌细胞中获得特异性表达,加用GCV后,还可高效杀伤AFP阳性肝癌细胞。 展开更多
关键词 PEG—PEI Fe3O4纳米磁流体 甲胎蛋白启动子 单纯疱疹病毒胸苷激酶
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肝细胞癌新型靶向基因治疗体系的构建及应用研究 被引量:2
3
作者 张鸽文 刘霆 王志明 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2012年第3期563-567,592,共6页
构建肝细胞癌(HCC)新型靶向基因治疗体系,并以存活素(survivin)基因为靶点,探讨该体系体外杀伤肝癌细胞的作用。构建由巨细胞病毒(CMV)增强子和甲胎蛋白(AFP)启动子构成的融合启动子(AV)驱动的pcD-NA3.1(-)AV质粒,及含绿色荧光蛋白(GFP)... 构建肝细胞癌(HCC)新型靶向基因治疗体系,并以存活素(survivin)基因为靶点,探讨该体系体外杀伤肝癌细胞的作用。构建由巨细胞病毒(CMV)增强子和甲胎蛋白(AFP)启动子构成的融合启动子(AV)驱动的pcD-NA3.1(-)AV质粒,及含绿色荧光蛋白(GFP)的pcDNA3.1(-)AVGFP和含siRNA-survivin的pcDNA3.1(-)AV-siRNA-survivin质粒,以磷酸钙纳米为载体,导入HepG2、SMMC-7721和Hela细胞中,观察转染效率及体外对肝癌细胞的杀伤效应,并采用流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率。结果显示:AV启动子可特异性驱动下游基因在HepG2细胞表达。此外,pcDNA3.1(-)AVsiRNA-survivin在HepG2细胞中可有效沉默survivin的mRNA和蛋白表达,并诱导68.8%的细胞死亡,而在Hela和SMMC-7721细胞中无显著作用。生长曲线结果显示,转染了pcD-NA3.1(-)AVsiRNA-survivin的HepG2细胞的生长显著受抑(P<0.05)。结果表明,该新型靶向基因治疗体系可高选择性作用于肝癌细胞,可为临床肝癌的基因治疗提供新的研究思路。 展开更多
关键词 肝细胞癌 基因治疗 甲胎蛋白启动子 存活素 纳米载体
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一种更有效的肝癌靶向性条件复制型腺病毒的构建及体外抑瘤作用 被引量:5
4
作者 傅强 王慧萍 +4 位作者 韦芳 李慧明 陈霞芳 王煜非 黄倩 《现代生物医学进展》 CAS 2009年第10期1801-1804,1831,共5页
目的:分别构建以甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)300bp启动子和800bp增强子-300bp启动子调控复制的条件复制型腺病毒(CRAd),对两种病毒的条件复制性以及溶瘤作用进行比较,为肝癌靶向性治疗提供更优良的载体。方法:以HepG2基因组DNA为模... 目的:分别构建以甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)300bp启动子和800bp增强子-300bp启动子调控复制的条件复制型腺病毒(CRAd),对两种病毒的条件复制性以及溶瘤作用进行比较,为肝癌靶向性治疗提供更优良的载体。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,通过检测报告基因EGFP和luciferase的表达鉴定启动子和增强子的活性后,构建穿梭质粒pDC311-AFPp-E1A,pDC311-AFPep-E1A并包装出腺病毒Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A。利用Western blot、病毒增殖、细胞病变、细胞活力等鉴定并比较两种病毒的复制能力和溶瘤作用。结果:Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A均可在AFP阳性细胞中选择性复制并且具有一定的溶瘤作用,以后者的选择复制性和溶瘤性更为明显。感染病毒Ad.AFPp-E1A后的HepG2、Hep3B细胞的存活率分别为(54.23±7.13)%、(61.18±12.63)%;感染病毒Ad.AFPep-E1A后的HepG2、Hep3B细胞存活率分别为(26.65±5.43)%、(24.49±3.31)%。结论:被截短的800bp增强子片断,在对AFP启动子起到增强作用的同时,可以为腺病毒包装进更多的治疗基因提供空间,从而为肝癌靶向治疗提供更为良好的条件复制型病毒载体。 展开更多
关键词 条件复制型腺病毒载体 甲胎蛋白启动子 甲胎蛋白增强子
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AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达 被引量:3
5
作者 李青春 梁淑娟 +3 位作者 王雪净 刘艳艳 王焕芹 张素华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期603-605,共3页
目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因... 目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因,将其克隆至pIRES2-EGFP载体,构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因,克隆至pafpIRES2-EGFP,进行酶谱分析及DNA序列测定。利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞,倒置相差荧光显微镜下观察,RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化。结果:SOE-PCR方法获得长度为537bp的AFP和ECMV嵌合基因,克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP,获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,细胞转染分析证实,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达,RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高。结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β。 展开更多
关键词 IL-1Β afp启动子 组织特异性 肝癌
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两种不同AFP启动子控制下表达HIV vpr基因的重组非复制型腺病毒获得及鉴定 被引量:2
6
作者 魏强 李凡 +2 位作者 王健伟 郭丽 洪涛 《中国实验诊断学》 2004年第2期132-134,共3页
目的 构建及包装由全长 5 1kbAFP启动子和低氧反应元件 (HRE)与 0 3kbAFP启动子两者组合的杂合0 3kbAFP启动子控制下表达HIVvpr基因的两种重组非复制型腺病毒。方法 采用细菌内同源重组腺病毒载体制备方法和PacI酶切、PCR、Souther... 目的 构建及包装由全长 5 1kbAFP启动子和低氧反应元件 (HRE)与 0 3kbAFP启动子两者组合的杂合0 3kbAFP启动子控制下表达HIVvpr基因的两种重组非复制型腺病毒。方法 采用细菌内同源重组腺病毒载体制备方法和PacI酶切、PCR、SouthernBlot鉴定方法。结果 构建及包装出由这两种AFP启动子控制下表达HIVvpr基因的重组非复制型腺病毒 ,经PacI酶切、PCR和SouthernBlot基因整合分析证明构建成功。结论 我们成功构建了的全长5 1kbAFP启动子和HRE与 0 3kbAFP启动子两者组合的杂合 0 3kbAFP启动子控制下表达HIVvpr基因的重组非复制型腺病毒 。 展开更多
关键词 afp启动子 HIV VPR基因 基因表达 非复制型腺病毒 低氧反应元件 HRE 治疗
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转录抑制因子ZHX2对AFP启动子的抑制作用 被引量:3
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作者 申红玉 栾芳 +4 位作者 刘华 鞠瑛 郭春 曹英林 马春红 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期311-315,共5页
目的:探讨转录抑制因子ZHX2对人甲胎蛋白(AFP)启动子的抑制作用。方法PCR扩增人ZHX2基因,构建ZHX2与绿色荧光蛋白和HA-tag融合表达载体pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA,共转染后通过荧光显微镜及Western blot检测融合基因的表达。扩增人... 目的:探讨转录抑制因子ZHX2对人甲胎蛋白(AFP)启动子的抑制作用。方法PCR扩增人ZHX2基因,构建ZHX2与绿色荧光蛋白和HA-tag融合表达载体pEGFP-ZHX2、pcDNA-ZHX2-HA,共转染后通过荧光显微镜及Western blot检测融合基因的表达。扩增人AFP核心启动子269bp插入pGl3-Basic,构建报告质粒phAF269。将pcDNA-ZHX2-HA和phAF269共转染HepG2细胞。48h后裂解细胞,双荧光检测分析ZHX2对AFP启动子的抑制作用。结果荧光显微镜及westem blot检测证实pEGFP-ZHX2和pcDNA-ZHX2-HA可在体外有效表达ZHX2融合蛋白,双荧光实验表明报告质粒phAF269具有AFP启动子活性,且pcDNA-ZHX2-HA与phAF269共转染HepG2后可显著抑制AFP启动子的转录作用,此抑制作用具有剂量依赖性。结论:成功构建两种新型转录抑制因子ZHX2融合表达载体,并证实其对人AFP启动子的抑制作用,为进一步探讨肝癌发生中AFP表达调控机制及提高AFP介导的靶向肿瘤基因治疗提供基础资料。 展开更多
关键词 ZHX2 afp启动子 转录因子 抑制作用
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AFP启动子对绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的影响 被引量:3
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作者 茆灿泉 黄常志 +4 位作者 杨树德 赵玫 范云霞 徐枫 杜菲 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期495-498,共4页
目的研究AFP5′端3.1kb启动子序列对GFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法首先采用重组DNA技术,构建了由AFP5′端前导序列AFP启动子+AFPEI增强子,3.1kb调控的绿色荧光蛋白GFP报告基因哺乳动物表达载体pcDNA3-GFP-AFP-w,然后将pcDN... 目的研究AFP5′端3.1kb启动子序列对GFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法首先采用重组DNA技术,构建了由AFP5′端前导序列AFP启动子+AFPEI增强子,3.1kb调控的绿色荧光蛋白GFP报告基因哺乳动物表达载体pcDNA3-GFP-AFP-w,然后将pcDNA3-GFP-AFP-w、pcDNA3-GFP及空载(pcDNA3-neo)经lipofectin分别转染Bel7402、Hela二种肿瘤细胞,G418抗性筛选得到含各不同质粒的稳定阳性细胞克隆,Westernblotting和密度积分扫描检测GFP基因的表达。结果转染pcDNA3-GFP-AFP-w细胞的GFP表达量在Bel7402中明显高于Hela细胞,在Hela细胞中GFP几乎不表达,但均低于相应转染pcDNA3-GFP的细胞,呈现一定的专一性。结论AFP5′端3.1kb启动子序列调控的GFP报告基因载体pcDNA3-GFP-AFP-w对Bel7402肝癌细胞呈现一定的细胞专一性。 展开更多
关键词 报告基因 GFP afp启动子 转染 绿色荧光蛋白 肝癌 肝细胞癌
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肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达 被引量:1
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作者 周梅芳 高三度 +4 位作者 王立文 林彬 朱杰敏 孙健 苏长青 《临床肿瘤学杂志》 CAS 2005年第6期565-568,共4页
目的:克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法:采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出... 目的:克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法:采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。WesternBlot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应(CPE)观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论:采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。 展开更多
关键词 肝癌 afp启动子 P16基因 腺病毒 基因治疗
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含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡及相关机制研究 被引量:2
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作者 陈永安 张亚妮 +4 位作者 顾伟 李柏 张薇薇 董惠娟 凌昌全 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2010年第5期283-286,共4页
目的:探讨含有AFP启动子的携蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡的相关机制。方法:采用AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒(Ad-rAFP-Mel)感染HepG2细胞后的凋亡情况;采用罗丹明123、PI双染色法检测线粒... 目的:探讨含有AFP启动子的携蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡的相关机制。方法:采用AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒(Ad-rAFP-Mel)感染HepG2细胞后的凋亡情况;采用罗丹明123、PI双染色法检测线粒体膜电位的变化,Fura-2染色检测细胞内Ca2+变化。结果:Ad-rAFP-Mel感染HepG2细胞后发生明显的细胞凋亡,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子的浓度升高。结论:结果提示感染后表达的内源性蜂毒素可能通过影响线粒体、内质网等结构,从而诱导AFP阳性的肝癌细胞凋亡。 展开更多
关键词 蜂毒素基因 腺病毒 甲胎蛋白启动子 生物膜 细胞凋亡
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AFP表达调控载体对肝癌模型的靶向治疗作用 被引量:1
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作者 张焕铃 侯洁 +4 位作者 王俊霞 尤红煜 郑龙 连伟光 刘树锋 《四川动物》 CSCD 北大核心 2013年第4期605-608,共4页
目的观察甲胎蛋白(AFP)表达调控载体pAFP-P53-EGFP对AFP表达阳性肝癌模型靶向治疗作用。方法以人肝癌HepG2(AFP阳性)、人肝癌SMMC7721(AFP阴性)细胞于BALB/c-nu裸小鼠右腋皮下荷瘤,14d成瘤,免疫组化检测AFP。将构建好的pAFP-EGFP和pAFP-... 目的观察甲胎蛋白(AFP)表达调控载体pAFP-P53-EGFP对AFP表达阳性肝癌模型靶向治疗作用。方法以人肝癌HepG2(AFP阳性)、人肝癌SMMC7721(AFP阴性)细胞于BALB/c-nu裸小鼠右腋皮下荷瘤,14d成瘤,免疫组化检测AFP。将构建好的pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP重组质粒于肿瘤内注射,观察肿瘤体积变化,通过免疫组化观察p53在HepG2肿瘤中的特异性表达及对肿瘤细胞的杀伤作用。结果荷HepG2、SMMC7721细胞株裸鼠14d皮下肿瘤生长良好,且肿瘤体积均为500mm3左右,经HE染色证实造模成功。同时,AFP免疫组化结果显示接种HepG2细胞的肿瘤组织AFP表达阳性,SMMC7721细胞的肿瘤组织AFP表达为阴性。经pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP重组质粒治疗后,p53的免疫组化分析结果显示接种HepG2细胞的裸鼠pAFP-P53-EGFP治疗组p53表达量显著高于其他各组,可见明显细胞凋亡现象,且肿瘤体积较对照组减小。结论含AFP基因调控序列的pAFP-P53-EGFP载体可专一性地作用于AFP阳性肝癌细胞,引起肝癌细胞周期阻滞和凋亡。 展开更多
关键词 afp启动子 表达调控 P53 细胞周期阻滞 细胞凋亡
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含AFP启动子腺病毒载体构建的基础研究 被引量:1
12
作者 韩秀敏 张阳 《大连医科大学学报》 CAS 2005年第1期9-12,共4页
[目的 ]为提高基因治疗载体的靶向性 ,在现有的溶瘤性腺病毒基础上 ,应用细菌内同源重组方法构建含AFP启动子和E1A基因的条件复制性腺病毒载体。 [方法 ]应用限制性内切酶以及体外重组技术获取目的片段AFP -AP -IRES -E1Am并进行重组质... [目的 ]为提高基因治疗载体的靶向性 ,在现有的溶瘤性腺病毒基础上 ,应用细菌内同源重组方法构建含AFP启动子和E1A基因的条件复制性腺病毒载体。 [方法 ]应用限制性内切酶以及体外重组技术获取目的片段AFP -AP -IRES -E1Am并进行重组质粒的筛选 ;将目的片段插入Pshuttle穿梭质粒中 ;重组的Pshuttle质粒应用PmeI线性化 ,与含腺病毒骨架DNA、删除了腺病毒E1、E3区的 pAdEasy1质粒在BJ5 183大肠杆菌细胞中同源重组形成新重组体 ;抽提重组体DNA ,用PacI酶切后 ,转染至人胚肾细胞株HEk2 93细胞中进行复制包装 ,扩增纯化 ;进行病毒检测。[结果 ]经用具有Amp抗性及kan抗性的培养板和多种限制性内切酶酶切筛选 ,证实应用同源重组方法构建了含AFP启动子和目的基因E1A的腺病毒载体 ;该重组腺病毒可转染HEk2 93细胞 ,并进行有效复制。 [结论 ]成功构建了具有特异靶向性的条件复制腺病毒载体 ,为进一步研究该腺病毒的功能提供了条件。 展开更多
关键词 afp启动子 E1A 条件复制腺病毒 同源重组 肿瘤
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肝癌选择性溶瘤腺病毒的构建及其体外抑瘤作用
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作者 傅强 王慧萍 +4 位作者 韦芳 李慧明 陈霞芳 王煜非 黄倩 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期113-119,共7页
目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强... 目的:构建由AFP基因增强子-启动子调控,并携带自杀基因TK的新型条件复制型腺病毒载体,观察该载体的选择复制能力、溶瘤作用及其与前药GCV联合处理对肝癌细胞的杀伤作用。方法:以HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增AFP基因启动子(AFPp)和增强子(AFPe),构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPep-EGFPluc,再构建由AFPep调控E1A表达、并携带TK基因的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A/CMV-TK,利用AdMax系统包装腺病毒Ad.AFPep-E1A/CMV-TK;利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变效应实验、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定病毒的复制能力、溶瘤作用和对肝癌细胞的杀伤作用。结果:成功构建的腺病毒载体Ad.AFPep-E1A/CMV-TK在AFP阳性细胞中选择性复制,病毒自身具有一定的溶瘤作用;该病毒载体联合GCV前药系统处理肝癌细胞后,AFP阳性肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞的存活率分别为(10.35±1.07)%、(15.49±5.80)%,AFP阴性的张氏肝细胞和人肺癌NCIH460细胞的存活率分别为(73.55±4.36)%、(74.54±9.89)%(P<0.01)。结论:构建的新型溶瘤腺病毒载体具有选择性杀伤肝癌细胞的能力,在肝癌治疗方面有良好的应用前景。 展开更多
关键词 肝肿瘤 条件复制型腺病毒载体 HSV-1TK基因 甲胎蛋白基因启动子 甲胎蛋白基因增强子 病毒-基因治疗
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A novel liver-directed gene delivery system using an autonomously replicating vector specifically expressed in AFP positive hepatoma cells
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作者 颜子颖 乔健 +1 位作者 贡惠宇 侯云德 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS 1998年第1期80-86,共7页
A composite EBV based expression vector, pEBAF, was constructed with the 5′ flanking sequence of human α fetoprotein gene as a promoter. Complexed to galactosylated histone, this vector with a foreign DNA insertion ... A composite EBV based expression vector, pEBAF, was constructed with the 5′ flanking sequence of human α fetoprotein gene as a promoter. Complexed to galactosylated histone, this vector with a foreign DNA insertion could be transferred into hepatic cells via the asialoglycoprotein receptor mediated endocytosis pathway. It was replicated as an episome, and its expression was restricted to the AFP positive hepatoma cells. This new gene delivery method has the following advantages: (i) absence of a potential toxicity is related to viral vectors; (ii) the targeting is specific to AFP positive hepatoma cells; (iii) the introduction of the EBV replicon into this system results in the high level expression and long term maintenance of the transferred gene. This novel gene delivery system has potential applications in gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma. 展开更多
关键词 EBV REPLICON VECTOR afp promoter receptor mediated gene transfer HEPATOMA cell.
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肝癌靶向性腺病毒载体的构建及其作用的研究 被引量:1
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作者 徐丁尧 杜芝燕 +3 位作者 王妍 陈惠华 徐元基 陆应麟 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第7期798-804,共7页
背景与目的:抑癌基因p16是肿瘤基因治疗最常用的治疗基因之一,通过腺病毒载体介导p16基因表达引发肿瘤细胞凋亡在多种p16基因失活的肿瘤细胞系中都得到了证实。研究表明,p16在人原发性肝细胞癌中存在高频率失活。因此,本研究通过观察外... 背景与目的:抑癌基因p16是肿瘤基因治疗最常用的治疗基因之一,通过腺病毒载体介导p16基因表达引发肿瘤细胞凋亡在多种p16基因失活的肿瘤细胞系中都得到了证实。研究表明,p16在人原发性肝细胞癌中存在高频率失活。因此,本研究通过观察外源性p16基因经AFP启动子驱动表达后对AFP阳性肝癌细胞的影响,以探讨p16基因在肝癌靶向基因治疗中应用的可行性。方法:将外源性p16基因置于人AFP核心启动子AF0.3下游,构建了携带p16基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad-AFP-p16,感染肝癌细胞后,应用MTT比色法、Westernblot、DNA片段化分析、流式细胞术分析等方法在体外研究外源性p16基因表达对细胞生长的影响。小鼠皮下接种感染重组腺病毒的鼠肝癌细胞H22,观察病毒对肝癌细胞体内成瘤性的影响。结果:感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞高效表达P16蛋白,MTT结果显示细胞生长受到明显抑制,到第六天Ad-AFP-p16对肝癌细胞Bel-7402和HepG2的生长抑制率分别为(94.42±11.70)%和(94.99±6.74)%,DNA片段化分析和流式细胞术分析证实p16能诱导肝癌细胞发生显著凋亡,感染后48hBel-7402和HepG2的凋亡率分别为39.57%和39.75%。感染Ad-AFP-p16的肝癌细胞体内成瘤受到明显抑制,对照组、Ad-GFP组、Ad-AFP-p16组以及Ad-CMV-p16组瘤体体积分别为(1.54±0.65)cm3、(1.71±1.01)cm3、(0.25±0.39)cm3和(0.25±0.45)cm3。结论:AFP启动子驱动p16基因表达可以诱导肝癌细胞发生凋亡。 展开更多
关键词 肝肿瘤 P16 甲胎蛋白启动子 细胞凋亡 靶向性载体
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pAFP-P53-EGFP靶向诱导AFP阳性肝癌细胞凋亡
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作者 张焕铃 刘福英 +4 位作者 王俊霞 连伟光 尤红煜 郑龙 刘健敏 《医学动物防制》 2011年第5期442-444,F0003,共4页
目的研究pAFP-P53-EGFP对AFP阳性肝癌细胞的靶向促凋亡作用。方法将SD大鼠AFP启动子、沉默子和远端增强子Ⅲ组合为1.2kb的AFP基因调控序列,导入pEGFP-N1质粒的启动子处,构建pAFP-EGFP同时引入P53基因片段,构建pAFP-P53-EGFP重组质粒。转... 目的研究pAFP-P53-EGFP对AFP阳性肝癌细胞的靶向促凋亡作用。方法将SD大鼠AFP启动子、沉默子和远端增强子Ⅲ组合为1.2kb的AFP基因调控序列,导入pEGFP-N1质粒的启动子处,构建pAFP-EGFP同时引入P53基因片段,构建pAFP-P53-EGFP重组质粒。转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,流式细胞术分析各细胞凋亡情况。分别将质粒pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP转染HepG2细胞进行DNA ladder分析及电镜观察细胞超微结构。结果 pAFP-P53-EGFP重组质粒转染HepG2、SMMC7721、HeLa细胞,各组细胞凋亡率分别为:HepG2组%gate=2.65±0.08;HeLa组%gate=0.42±0.025;SMMC7721组%gate=0.39±0.018。AFP阳性的HepG2细胞凋亡率明显高于SMMC7721、HeLa细胞(P<0.05)。且转染pAFP-P53-EGFP质粒的HepG2细胞出现明显的DNA ladder,细胞超微结构亦显示出现凋亡。结论 pAFP-P53-EGFP可以在AFP阳性细胞中相对专一表达,且pAFP-P53-EGFP可通过诱导细胞凋亡从而达到抑制肿瘤作用。 展开更多
关键词 afp启动子 表达调控 P53 细胞周期阻滞 细胞凋亡
原文传递
肝癌组织特异性P_(afp)IRES2-EGFP表达载体的构建及表达
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作者 牟东珍 梁淑娟 +3 位作者 刘艳艳 王雪净 吴慧娜 李若葆 《潍坊医学院学报》 2008年第3期199-201,I0001,共4页
目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启... 目的构建AFP最小启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体,观察其在小鼠H22肝癌细胞中的特异性表达。方法从H22细胞总DNA和荧光载体pIRES2-EGFP中分别PCR扩增AFP最小启动子区序列和CMV增强子(ECMV),利用重叠延伸PCR方法(SOE)获得AFP启动子驱动的嵌合调控序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染H22肝癌细胞和YAC1淋巴瘤细胞,荧光显微镜下观察其表达的组织特异性。结果从小鼠H22细胞DNA和pIRES2-EGFP中分别扩增得到229bp和324bp的片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一537bp的条带,均与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经Nde I+NheⅠ限制性酶谱分析酶解出537bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的嵌合DNA与GeneBank中小鼠AFP启动子和ECMV序列完全一致。结论本研究成功构建了AFP启动子调控的小鼠肝癌组织特异性表达载体PafpIRES2-EGFP,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达外源基因。 展开更多
关键词 肝癌 组织特异性表达 afp启动子
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FP启动子调控增强型绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的研究 被引量:4
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作者 郝萍 王东林 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第20期1857-1859,共3页
目的 研究人 0 3kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物 ,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子 (AFPpromoter)序列 ,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP... 目的 研究人 0 3kb的AFP启动子序列对EGFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法 通过设计含有特定酶切位点的引物 ,选择性地从人基因组中扩增出人甲胎蛋白启动子 (AFPpromoter)序列 ,分别构建含有AFP启动子序列和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)及AFP启动子序列和DTA基因的真核表达载体pAF EGFP、pAF DTA ;将pAF EGFP转染HepG2、SMMC 772 1及NIH3T3后进行荧光强度检测。结果 转染pAF EGFP质粒细胞的EGFP表达量在HepG2细胞中明显高于SMMC 772 1、NIH3T3细胞 ,组间差异显著 (P <0 0 1)。结论 AFP启动子可以特异性地启动它后面的目的基因在AFP阳性的细胞中高效表达。 展开更多
关键词 afp 人肝癌细胞 启动子 EGFP 高效表达 增强型绿色荧光蛋白 SMMC-7721 酶切位点 目的基因 表达量
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miR-29c互补序列与AFP启动子在肝癌基因靶向治疗中的应用研究 被引量:2
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作者 张友琴 陶冶 《中国现代医药杂志》 2013年第8期30-33,共4页
目的建立基于肿瘤特异性启动子和microRNA(miR)互补序列的肝癌基因靶向治疗系统。方法分别检测甲胎蛋白AFP启动子和miR-29c在不同的人肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达活性;比较分析AFP启动子和新的靶向系统AFP-MiR-29c-TS(miR-29c-TS,... 目的建立基于肿瘤特异性启动子和microRNA(miR)互补序列的肝癌基因靶向治疗系统。方法分别检测甲胎蛋白AFP启动子和miR-29c在不同的人肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达活性;比较分析AFP启动子和新的靶向系统AFP-MiR-29c-TS(miR-29c-TS,miR-29c互补序列)在肝癌细胞株中的靶向特征;对比分析AFP-E1A和AFP-MiR-29c-TS-E1A在肝癌治疗中的疗效和特异性差异。结果 AFP启动子在人肝癌细胞株HepG2和Huh7中特异性高表达,miR-29c在人肝细胞株LO2中特异性高表达;在肝细胞株中,AFP-MiR-29c-TS的活性较AFP启动子明显降低(P<0.01);AFP-E1A和AFP-MiR-29c-TS-E1A在肝癌治疗中的疗效差异不具有统计学意义。结论 AFP-MiR-29c-TS是肝癌基因靶向治疗安全、有效的载体系统。 展开更多
关键词 肝癌 afp启动子 microRNA(miR) 靶向治疗
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