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猪瘟病毒C株截短E2基因在大肠杆菌中表达及免疫原性初步检测 被引量：4
1
作者 郑仲华 李东升 +6 位作者 姚俊庸 常艳 勾红潮 刘文俊 赵明秋 毛晶丹 陈金顶 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第5期12-16,共5页
本试验利用PCR技术,扩增得到猪瘟病毒(CSFV)C株E2基因的主要抗原片段A/D区549bp,将其酶切纯化后,与已酶切纯化的pET-32a进行16℃过夜连接,转化大肠杆菌BL21。从转化成功的氨苄培养板挑取合适菌落进行PCR,挑取目的条带正确的菌落加至LB... 本试验利用PCR技术,扩增得到猪瘟病毒(CSFV)C株E2基因的主要抗原片段A/D区549bp,将其酶切纯化后,与已酶切纯化的pET-32a进行16℃过夜连接,转化大肠杆菌BL21。从转化成功的氨苄培养板挑取合适菌落进行PCR,挑取目的条带正确的菌落加至LB培养基进行过夜培养后送测序。将测序正确的菌液划板,挑菌培养并用IPTG进行诱导表达。得到的蛋白进行SDS-PAGE,在约39ku位置有蛋白条带。将蛋白纯化后,分别利用自制兔抗CSFV阳性血清及临床检测阳性的猪抗CSFV阳性血清进行Western blotting检测,可见在39ku处有单一条带,表明表达的蛋白具有免疫原性。本试验结果为下一步ELSIA试剂盒的组装奠定基础,方便对猪场免疫猪群猪瘟抗体水平进行监控。 展开更多
关键词 猪瘟病毒C株 A D主要抗原区 截短表达
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鸭坦布苏病毒E基因主要抗原域的原核表达及单克隆抗体的制备 被引量：1
2
作者 孙涛 王超 +4 位作者 徐彪 王宏华 邓明俊 郑小龙 岳志芹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期496-499,共4页
为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因主要抗原域的单克隆抗体(MAb),本研究经DNAStar软件分析预测E蛋白含有的优势抗原表位区,以DTMUV QD株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增涵盖编码主要优势表位的E基因片段(943 bp^1 287 bp),并将其克隆至表... 为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因主要抗原域的单克隆抗体(MAb),本研究经DNAStar软件分析预测E蛋白含有的优势抗原表位区,以DTMUV QD株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增涵盖编码主要优势表位的E基因片段(943 bp^1 287 bp),并将其克隆至表达载体p ET-28a中,转化于大肠杆菌中进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行western blot鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0细胞融合,经筛选和鉴定,获得了两株能够稳定分泌抗E蛋白的杂交瘤细胞株,命名为4G8和6B12,其亚型均为Ig G1型,并且识别于不同的抗原位点。经间接免疫荧光检测,MAb 4G8和6B12均能够与DTMUV发生特异性反应。本研究所制备的MAb为进一步鉴定DTMUV以及分析囊膜糖蛋白E的结构和功能奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒 抗原域 原核表达 单克隆抗体
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鸭甲肝病毒VP1蛋白主要抗原域的原核表达及间接ELISA方法的初步建立
3
作者 孙涛 李传峰 +2 位作者 徐彪 邓明俊 岳志芹 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第2期7-14,共8页
根据已发表的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)疫苗株A66株基因组序列,利用生物学分析软件DNAStar进行VP1蛋白的二级结构和抗原域预测,确定其主要抗原域(major antigen domain of VP1,VP1M),设计并合成一对可扩增VP1M的特异性引... 根据已发表的鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)疫苗株A66株基因组序列,利用生物学分析软件DNAStar进行VP1蛋白的二级结构和抗原域预测,确定其主要抗原域(major antigen domain of VP1,VP1M),设计并合成一对可扩增VP1M的特异性引物,PCR扩增获得长为327 bp的VP1M基因片段。将VP1M基因片段定向克隆至p GEX-4T-1表达载体中,鉴定正确后进行IPTG诱导表达,获得了以包涵体为主的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经过Western blot检测表明重组蛋白具有良好的抗原性。以该蛋白作为包被抗原,成功建立了检测DHAV-1的间接ELISA方法。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为DHAV的快速诊断、流行病学调查和免疫鸭群的抗体检测提供了快速实用的检测手段。 展开更多
关键词 鸭甲肝病毒 VP1 抗原域 间接ELISA
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犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究 被引量：5
4
作者 吴植 曹斌 +2 位作者 贺生中 戴建华 吴迪 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期473-476,共4页
为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p ... 为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p VAX1-VP2-228。Western blot结果显示VP2-228能够在COS-7细胞中正确表达。将该重组质粒免疫小鼠,利用血凝抑制试验检测不同时期的抗体水平,以MTT法检测免疫35 d时淋巴细胞的增殖活性。结果表明p VAX1-VP2-228能够诱导小鼠产生较高的抗体水平;淋巴细胞增殖试验表明免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数显著高于对照组(p<0.05)。本研究为开展CPV DNA疫苗的研究提供了实验依据。 展开更多
关键词 犬细小病毒 VP2蛋白 主要抗原表位 免疫原性
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猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立 被引量：1
5
作者 范朋举 曹轶梅 +9 位作者 卢曾军 张萌 孙普 付元芳 李平花 白兴文 包慧芳 陈应理 李冬 刘在新 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期902-908,共7页
利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0... 利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2蛋白主要抗原表位区 原核表达 间接ELISA 血清检测
原文传递
靶向CD138嵌合抗原受体修饰T细胞的构建及其抗多发性骨髓瘤作用研究
6
作者 国承彩 卢杨 +6 位作者 唐克晶 邢海燕 田征 饶青 王敏 熊冬生 王建祥 《中华血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期436-444,共9页
目的构建一种新型靶向CD138的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,探索其抗恶性浆细胞肿瘤作用。方法通过单克隆抗体制备及筛选技术,获得能稳定分泌CD138抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔,收集腹水并纯化得到抗CD138抗体纯品,进一... 目的构建一种新型靶向CD138的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞,探索其抗恶性浆细胞肿瘤作用。方法通过单克隆抗体制备及筛选技术,获得能稳定分泌CD138抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔,收集腹水并纯化得到抗CD138抗体纯品,进一步检测抗体特异性及亲和力;RT-PCR扩增其可变区序列,以此作为抗原识别域构建CD138 CAR,并表达于T细胞表面,制备CD138 CAR-T;流式细胞术检测CAR-T细胞表型特征;体外杀伤及脱颗粒实验检测其抗肿瘤作用。结果①成功制备抗人CD138抗体杂交瘤细胞株,并筛选获得稳定分泌抗人CD138抗体的杂交瘤细胞株5G2。②CD138(5G2)抗体可以特异性识别CD138+细胞,与CD138蛋白亲和常数(KD)为6.011×10^(-9)mol/L,与CD138-细胞无明显交叉反应。③应用分子克隆技术扩增得到CD138(5G2)抗体可变区序列,成功构建CD138(5G2)CAR慢病毒载体,通过感染T细胞获得的CD138(5G2)CAR-T细胞,可以有效结合人CD138重组蛋白。④CD138(5G2)CAR-T可以有效大量扩增,表型检测发现CD138(5G2)CAR-T细胞更多的向中心记忆T及记忆干细胞方向分化,终末分化效应T细胞比例降低。⑤与靶细胞共培养48 h后,与Vector-T细胞相比,CD138(5G2)CAR-T细胞可以有效杀伤CD138+骨髓瘤细胞系H929[效靶比为1∶2,(12.92±8.02)%对(54.25±15.79)%,P<0.001]。但对CD138-K562细胞系无明显杀伤作用。⑥脱颗粒实验显示,H929细胞可以显著激活CD138(5G2)CAR-T细胞,但对Vector-T细胞无明显激活作用[(25.78±3.35)%对(6.13±1.30)%,P<0.001]。⑦与CD138+细胞共培养后CD138(5G2)CAR-T分泌细胞因子水平较Vector-T组明显升高[IL-2:(1697.52±599.05)pg/ml对(5.07±1.17)pg/ml,P<0.001;IFN-γ:(3312.20±486.38)pg/ml对(9.28±1.46)pg/ml,P<0.001;TNF-α:(1837.43±640.49)pg/ml对(8.75±1.65)pg/ml,P<0.001],但与CD138-细胞共培养后两组间细胞因子分泌水平无明显差异。结论本研究成功制备了抗CD138单克隆抗体,以其抗原识别域构建� 展开更多
关键词 嵌合抗原受体 抗原识别区 多发性骨髓瘤 CD138 免疫治疗
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癌-睾丸抗原LEMD1在乳腺癌中的表达及其生物学功能初探
7
作者 李海可 苏攀柯 +2 位作者 马静 王文娟 许丹阳 《现代免疫学》 CAS 北大核心 2022年第3期193-200,共8页
为探讨癌-睾丸抗原LEMD1(LEM domain containing 1)在乳腺癌(breast cancer,BC)中的表达及其对疾病预后的价值,探究LEMD1在BC中发挥的生物学功能及作用机制,采用组织芯片结合免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测BC组织中LEMD1的表达... 为探讨癌-睾丸抗原LEMD1(LEM domain containing 1)在乳腺癌(breast cancer,BC)中的表达及其对疾病预后的价值,探究LEMD1在BC中发挥的生物学功能及作用机制,采用组织芯片结合免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测BC组织中LEMD1的表达,Kaplan-Meier法分析LEMD1表达与BC患者生存时间的相关性;构建LEMD1过表达及敲减慢病毒载体,分别感染人BC细胞MDA-MB-468(低表达LEMD1)和MCF-7(中表达LEMD1);通过CCK-8、Transwell侵袭迁移及TUNEL凋亡等实验探讨LEMD1过表达、敲减对人BC细胞生物学特性的影响;Western blotting检测PI3K/AKT通路相关蛋白的表达变化。结果显示,LEMD1在BC组织中阳性表达率为95.86%;生存分析显示,LEMD1高表达患者较低表达患者预后更差[风险比(hazard ratio,HR)=3.162,95%CI:1.748~5.721,P=0.0007]。体外功能实验显示,过表达LEMD1可显著促进MDA-MB-468细胞的生长增殖与迁移侵袭能力(均P<0.01),而敲减MCF-7细胞中内源性LEMD1后细胞的生长增殖、体外迁移侵袭能力被显著抑制,肿瘤细胞凋亡增加(均P<0.01)。Western blotting证实LEMD1过表达可显著上调PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达(均P<0.01),而LEMD1敲减后PI3K、AKT及相应磷酸化蛋白的表达显著下调(均P<0.01,P<0.05)。由此,LEMD1在BC中表达升高,可作为BC预后评估的重要指标;LEMD1在调控BC细胞生长和侵袭迁移等过程中发挥重要作用,可能与其激活PI3K/AKT信号通路有关。 展开更多
关键词 癌-睾丸抗原LEMD1 乳腺癌 预后 生物学功能 机制
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