甾体微生物转化反应关键酶3-甾酮-Δ~1-脱氢酶的研究进展 被引量：3

1

作者 贾红晨 李芳 +6 位作者 郑鑫铃 崔慧林 骆健美 申雁冰 王敏 田妥 丁安鹏 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期2218-2235,共18页

3-甾酮-Δ~1-脱氢酶是甾体化合物微生物代谢的关键酶,负责催化3-酮基类甾体化合物A环上的C1,2位脱氢反应。其不仅在甾体母核的早期降解途径中发挥重要作用,而且能通过A环C1,2位上双键的导入显著提高甾体化合物的生理活性。本文详细阐述... 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶是甾体化合物微生物代谢的关键酶,负责催化3-酮基类甾体化合物A环上的C1,2位脱氢反应。其不仅在甾体母核的早期降解途径中发挥重要作用,而且能通过A环C1,2位上双键的导入显著提高甾体化合物的生理活性。本文详细阐述了3-甾酮-Δ~1-脱氢酶在微生物中的种属分布和序列特征、酶的生物学特性、生理作用、催化机理以及分子改造等,为深入研究该酶在甾体生物转化领域中的应用提供重要参考。 展开更多

关键词 3-甾酮-δ~1-脱氢酶 甾体C1 2脱氢反应 生物学特性 生理作用 催化机理

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3-甾酮-1-脱氢酶在不同表达体系中的表达研究 被引量：1

2

作者 李玉 王稳航 +2 位作者 路福平 邹菁 杜连祥 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期6-10,共5页

简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶(KSDH),是甾体母核降解的关键酶,属于黄素蛋白类,并且是一种膜蛋白。膜蛋白的高效表达一直是一个难题。本文尝试利用三种不同的大肠杆菌表达体系,pET-30a/BL21(DE3)、pET-40b(+)/BL21(DE3)和pTrc99A/JM109对C... 简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶(KSDH),是甾体母核降解的关键酶,属于黄素蛋白类,并且是一种膜蛋白。膜蛋白的高效表达一直是一个难题。本文尝试利用三种不同的大肠杆菌表达体系,pET-30a/BL21(DE3)、pET-40b(+)/BL21(DE3)和pTrc99A/JM109对C1,2位脱氢酶进行诱导表达,并对蛋白的表达量和酶活力进行比较分析,确定出最适的表达系统。 展开更多

关键词 简单节杆菌 3-甾酮-1-脱氢酶 膜蛋白 表达体系

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3-甾酮-1-脱氢酶基因的表达及甾体转化分析(英文)

3

作者 李玉 路福平 +2 位作者 刘逸寒 戴永鑫 杜连祥 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期24-28,共5页

利用带有P43启动子的表达分泌载体pWB980,实现了简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达,表达出的目的蛋白的分子量为55kDa。利用分光光度法检测得到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为每毫克蛋白110±0.5mU和15±0.6... 利用带有P43启动子的表达分泌载体pWB980,实现了简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达,表达出的目的蛋白的分子量为55kDa。利用分光光度法检测得到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为每毫克蛋白110±0.5mU和15±0.6mU,比出发菌株简单节杆菌提高了将近30倍。重组芽孢杆菌对甾体底物4-AD(4-烯-雄甾-3,17-双酮)的转化率为45.3%,比出发菌株简单节杆菌提高了近10倍。利用枯草芽孢杆菌对甾体底物进行脱氢为甾体药物的生产开辟了一个新的途径。 展开更多

关键词 3-甾酮-1-脱氢酶枯草芽孢杆菌表达 甾体转化

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表达3-甾酮-△^(1)-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮 被引量：8

4

作者 张乐乐 张显 +4 位作者 邵明龙 陈榕榕 饶志明 李会 许正宏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1589-1600,共12页

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分... 构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。 展开更多

关键词 MYCOBACTERIUM neoaurum JC-12 ^3-甾酮-△^(1)-脱氢酶 tac启动子 雄甾-4-烯-3 17-二酮 雄甾-1 4-二烯-3

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表达KstD重组大肠杆菌转化甾体化合物的条件优化 被引量：1

5

作者 任尧 牛杨 +5 位作者 王薇伊 葛方兰 李江 杨欣 李维 陈贵英 《西南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2017年第10期43-50,共8页

3-甾酮-Δ1脱氢酶是胆固醇降解的关键酶之一,能脱去甾酮C1,2位上的氢原子,形成双键,在甾体药物的合成过程中具有重要的作用.以异源表达3-甾酮-Δ1脱氢酶的重组大肠杆菌为材料,对其培养条件以及黄体酮转化条件进行了优化,实现了甾体化合... 3-甾酮-Δ1脱氢酶是胆固醇降解的关键酶之一,能脱去甾酮C1,2位上的氢原子,形成双键,在甾体药物的合成过程中具有重要的作用.以异源表达3-甾酮-Δ1脱氢酶的重组大肠杆菌为材料,对其培养条件以及黄体酮转化条件进行了优化,实现了甾体化合物的高效转化.首先,对表达3-甾酮-Δ1脱氢酶基因的重组大肠杆菌的培养条件对黄体酮脱氢的影响进行了研究,结果表明,IPTG浓度为0.05mmol/L,在28℃,pH值为7的条件下诱导培养5h,获得最高转化活性的细胞;其次,以优化条件下获得的菌体为催化剂,研究了各种转化条件对底物转化的影响,结果表明,以甲基-β-环糊精为助溶剂,转化温度为37℃,底物质量浓度为6g/L,菌体量为100g/L,pH为7.0,黄体酮的转化率达到99%以上,比优化前的产量提高了2倍,转化率提高近1倍. 展开更多

关键词 3-甾酮-δ1脱氢酶 重组大肠杆菌 诱导 转化 黄体酮

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转化植物甾醇产22-羟基-23,24-双降甾-1,4-二烯-3-酮(HPD)工程菌株的构建及发酵培养基优化

6

作者 马治国 刘相岑 +4 位作者 袁辰阳 杜桂林 钮冰 张保国 史吉平 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2021年第15期131-138,共8页

22-羟基-23,24-双降甾-1,4-二烯-3-酮(HPD)作为一种重要的甾体药物中间体,是合成很多皮脂类药物的原材料。通过在分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum DSM 1381)体内过表达3-甾酮-Δ^(1)脱氢酶(KstD)基因,Mycobacterium neoaurum DSM 1381... 22-羟基-23,24-双降甾-1,4-二烯-3-酮(HPD)作为一种重要的甾体药物中间体,是合成很多皮脂类药物的原材料。通过在分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum DSM 1381)体内过表达3-甾酮-Δ^(1)脱氢酶(KstD)基因,Mycobacterium neoaurum DSM 1381Z菌株发酵液中HPD的产量由71%提高到84%。在单因素选择的基础上,以产物HPD的产量作为衡量指标,利用响应面方法优化发酵培养基,建立各个因素之间变化的二次回归方程。结果表明,最合适的发酵培养基组成条件是玉米浆9 g/L、硝酸钠1.8 g/L、葡萄糖6 g/L、磷酸氢二钾2 g/L。此条件下5 g/L的植物甾醇,HPD的产量可达3.73 g/L,HPD的产量比原始菌株提高了大约2.7倍,具备潜在的工业化应用价值。 展开更多

关键词 22-羟基-23 24-双降甾-1 4-二烯-3-酮 ^3-甾酮-δ^(1) 脱氢酶 菌株构建 发酵培养基 植物甾醇 微生物转化

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分枝杆菌Mycobacterium sp．M1甾酮C_(1,2)位脱氢酶活性的研究

7

作者 黄巍 别松涛 +1 位作者 王超 路福平 《天津科技大学学报》 CAS 2005年第4期14-17,共4页

分枝杆菌Mycobacteriumsp．M1可以有效降解大豆甾醇侧链得到雄甾4-烯-3,17-二酮 (AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。通过该菌株细胞和细胞裂解液对底物AD的转化,表明了该菌株中存在甾酮C1．2位脱氢酶。利用酶活测定中活力高的细胞裂... 分枝杆菌Mycobacteriumsp．M1可以有效降解大豆甾醇侧链得到雄甾4-烯-3,17-二酮 (AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。通过该菌株细胞和细胞裂解液对底物AD的转化,表明了该菌株中存在甾酮C1．2位脱氢酶。利用酶活测定中活力高的细胞裂解液可以有效地降解大豆甾醇生成ADD。 展开更多

关键词 分枝杆菌 大豆甾醇 甾酮C1 2位脱氢酶 雄甾4-烯-3 17-二N 雄甾-1 4-二烯-3 17-二酮

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表达KsdD重组大肠杆菌的构建及转化工艺优化

8

作者 汤睿 申雁冰 +2 位作者 耿宇菡 赵云秋 王敏 《山东农业大学学报（自然科学版）》 北大核心 2020年第1期19-24,共6页

3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)是催化甾体化合物C1,2位脱氢反应的关键酶,在甾体药物的生产中起着重要作用。本研究首先通过对红球菌、分枝杆菌及简单节杆菌来源的KsdD蛋白进行氨基酸序列分析,并进一步通过酶活比较及底物催化能力的验证,最终... 3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)是催化甾体化合物C1,2位脱氢反应的关键酶,在甾体药物的生产中起着重要作用。本研究首先通过对红球菌、分枝杆菌及简单节杆菌来源的KsdD蛋白进行氨基酸序列分析,并进一步通过酶活比较及底物催化能力的验证,最终筛选获得具有较高C1,2位脱氢活力的脱氢酶KsdDR2。研究了过表达KsdDR2蛋白重组大肠杆菌的转化条件对底物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)转化的影响,结果表明,在30℃转化条件下,当AD:羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)的摩尔比为1:1.5时,可使底物AD的转化率达99%以上。本研究为利用工程菌株高效生产C1,2位脱氢甾体化合物的研究奠定了理论基础。 展开更多

关键词 3-甾酮-△1-脱氢酶 大肠杆菌 微生物转化 雄甾-4-烯-3 17-二酮

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新金色分枝杆菌ksd D基因的敲除及其对菌株AD(D)合成的影响

9

作者 韩冷 田灵芝 +3 位作者 马正 徐美娟 夏海锋 饶志明 《工业微生物》 CAS CSCD 2011年第4期37-42,共6页

新金色分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum）能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮（AD）和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮（ADD），其中3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化为ADD的关键酶。本实验室在筛菌过程中筛选到-株能将甾... 新金色分枝杆菌（Mycobacteriumneoaurum）能将植物甾醇转化为药物中间体4-烯-雄甾-3，17-二酮（AD）和1，4-二烯-雄甾-3，17-二酮（ADD），其中3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化为ADD的关键酶。本实验室在筛菌过程中筛选到-株能将甾醇转化为AD（D）的菌株，经鉴定为M．neoaurum，本研究以该菌株为出发菌株，首先扩增出长度约1．7kb编码KSDD的ksdD基因全序列，在基因内部插入-段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km），将得到的基因元件ksdD：：Km电转化M．neoaurum，通过PCR验证获得稳定遗传的ksdD基因缺失重组转化子。研究结果表明，与原始菌株相比，缺失株KSDD酶活下降了85％，AD产量相比提高了1倍，ADD产量下降了35．2％。该研究证实了ksdD基因编码的3-甾酮-△1-脱氢酶（KSDD）是AD转化ADD的关键酶，为进-步研究KSDD酶学性质及阐明AD合成ADD的代谢机理奠定基础。 展开更多

关键词 新金色分枝杆菌 3-甾酮-△1-脱氢酶 ksdD

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3-甾酮-1-脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达及甾体转化研究 被引量：4

10

作者 李玉 王稳航 +2 位作者 刘逸寒 路福平 杜连祥 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第3期115-118,共4页

将简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)克隆到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上,构建重组质粒pET-ksdD,利用IPTG诱导酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,4h后取样,分别对超声破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE和酶活分析,结果表明表达出的3-甾酮... 将简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶基因(ksdD)克隆到大肠杆菌表达载体pET-22b(+)上,构建重组质粒pET-ksdD,利用IPTG诱导酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达,4h后取样,分别对超声破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE和酶活分析,结果表明表达出的3-甾酮-1-脱氢酶的分子量大约为56kD,超声破碎后的细胞破碎液对4-AD的转化率较简单节杆菌提高了近10倍。 展开更多

关键词 3-甾酮-1-脱氢酶 大肠杆菌 表达 甾体转化

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分枝杆菌Mycobacterium Neoaurum NwIB-01 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆表达 被引量：3

11

作者 张成刚 王风清 魏东芝 《化学与生物工程》 CAS 2011年第7期39-43,共5页

通过分析已知两种分枝杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(kstD)碱基保守序列,设计简并引物,以甾醇降解菌株Mycobacterium neoaurumNwIB-01的DNA作模板,得到一个kstD基因片段,通过染色体走读,得到其完整的阅读框。以pUC18为异源表达载体,构建pTQ00... 通过分析已知两种分枝杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(kstD)碱基保守序列,设计简并引物,以甾醇降解菌株Mycobacterium neoaurumNwIB-01的DNA作模板,得到一个kstD基因片段,通过染色体走读,得到其完整的阅读框。以pUC18为异源表达载体,构建pTQ002表达质粒,在E.coliDH5α中对kstD进行了胞内活性表达,测定Mycobacteri-um neoaurumNwIB-01 kstD酶活为(0.37±0.05)U.mL-1,约为原酶活的一半,为构建高效转化生成3-酮基-1,4-二烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。 展开更多

关键词 3-甾酮-δ1-脱氢酶 分枝杆菌 染色体走读

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烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定 被引量：2

12

作者 陈苗苗 林良才 +2 位作者 马昱澍 王风清 魏东芝 《化学与生物工程》 CAS 2011年第7期29-34,共6页

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159... 微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。 展开更多

关键词 烟曲霉 烟曲霉酸 3-甾酮-δ1-脱氢酶 雄甾-4-烯-3 17-二酮 雄甾-1 4-二烯-3 17-二酮

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