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鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因的克隆及表达 被引量：21
1
作者 龚晖 林天龙 +4 位作者 俞伏松 董传甫 陈日升 杨金先 陈振海 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期124-130,共7页
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养... 应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 鳗源嗜水气单胞菌 β-溶血素 基因克隆 基因表达 疫苗 鱼类 暴发性疾病 致病菌
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欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因序列分析 被引量：5
2
作者 龚晖 林天龙 +3 位作者 杨金先 刘晓东 陈红燕 许斌福 《福建农业学报》 CAS 2003年第1期29-33,共5页
对克隆的欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因AHL316HEM进行序列和结构分析表明,AHL316HEM基因读码框架全长为1 482 bp,编码长度为493个氨基酸的蛋白,分子量为54.2 kD,等电点为5.625,读码框架内有一个EcoRI酶切位点。AHL316HEM从起始位点至... 对克隆的欧鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因AHL316HEM进行序列和结构分析表明,AHL316HEM基因读码框架全长为1 482 bp,编码长度为493个氨基酸的蛋白,分子量为54.2 kD,等电点为5.625,读码框架内有一个EcoRI酶切位点。AHL316HEM从起始位点至第23个氨基酸残基形成一明显疏水区,可能构成信号肽,其抗原位点大部分都在亲水区,不具穿膜性。同源性分析表明,AHL316HEM基因编码的氨基酸序列与已报道的嗜水气单胞菌溶血素基因(accession No.BAA83088)的同源率为98％,与斑点气单胞菌溶血素基因(accessionNo.U40711)、温和气单胞菌溶血素基因(accession No.AF443393)的同源率分别为84％和72％,与霍乱弧菌溶血素基因(accession No.AF540655)、副溶血弧菌溶血素基因(accession No.VIBTRH2A)、金黄葡萄球菌β-溶血素基因(accession No.S72497)的同源性分别为7％、5％和4％。这一结果提示,气单胞菌属内各菌种的溶血素基因可能有共同的起源。 展开更多
关键词 欧鳗 嗜水气单胞菌 β—溶血素 基因序列 基因克隆
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牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析 被引量：7
3
作者 杨钦 王长法 +4 位作者 杨宏军 杨少华 高运东 仲跻峰 彭广能 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期324-330,共7页
【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用9... 【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 克隆 表达 溶血活性 CAMP反应
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牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析 被引量：3
4
作者 杨钦 王长法 +4 位作者 杨宏军 杨少华 高运东 仲跻峰 彭广能 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第1期187-191,共5页
根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含... 根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 溶血素 克隆 表达
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奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达
5
作者 杨钦 王长法 +4 位作者 杨宏军 杨少华 高运东 仲跻峰 彭广能 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期572-575,共4页
以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-... 以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 克隆 表达
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金黄色葡萄球菌β-溶血素基因缺失突变菌株构建的研究 被引量：1
6
作者 管章春 韩殿鹏 +4 位作者 李静静 刘成华 高亚萍 刘玉 杨光 《抗感染药学》 2018年第3期379-383,共5页
目的:研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)β-溶血素基因(hlb)缺失突变菌株的构建。方法:提取金葡菌COL基因组DNA,采用PCR扩增hlb基因上下游片段,构建同源重组序列;将卡那霉素抗性基因(kan)与同源重组序列连接,构建含有kan基因的同源重组序列;... 目的:研究金黄色葡萄球菌(金葡菌)β-溶血素基因(hlb)缺失突变菌株的构建。方法:提取金葡菌COL基因组DNA,采用PCR扩增hlb基因上下游片段,构建同源重组序列;将卡那霉素抗性基因(kan)与同源重组序列连接,构建含有kan基因的同源重组序列;利用卡那霉素和氯霉素筛选获得已同源重组菌株和PCR、RTPCR和Western blot方法鉴定突变菌株中hlb基因的表达。结果:基因组PCR结果显示,突变菌株COL^(hlb)的基因组缺失hlb基因,以及进一步的RT-PCR和Western Blot结果均表明COL^(hlb)菌株不表达hlb。结论:金葡菌hlb基因敲除菌株COL^(hlb)构建成功,为β-溶血素参与金葡菌致病过程的机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 β-溶血素 突变菌株 基因敲除 同源重组
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牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素CylE基因对牛巨噬细胞炎性细胞因子的转录和表达及对信号通路MAPK的影响机制研究 被引量：1
7
作者 布日额 吴金花 +1 位作者 锡林高娃 王华 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2021年第10期1178-1182,共5页
目的探讨牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素CylE基因对牛巨噬细胞吞噬功能的免疫调理分子机制。方法利用牛乳腺炎无乳链球菌临床分离野生菌株及β溶血素CylE基因缺失突变株对牛巨噬细胞进行侵染,提取侵染细胞的总mRNA;利用qPCR检测细胞因子Il-... 目的探讨牛乳腺炎无乳链球菌β溶血素CylE基因对牛巨噬细胞吞噬功能的免疫调理分子机制。方法利用牛乳腺炎无乳链球菌临床分离野生菌株及β溶血素CylE基因缺失突变株对牛巨噬细胞进行侵染,提取侵染细胞的总mRNA;利用qPCR检测细胞因子Il-8、Il-10、Il-12、TNFα及NOS2的转录水平,ELISA检测相应表达水平。在此基础上,利用免疫印迹实验鉴定无乳链球菌β溶血CylE基因对MAPK信号通路下游接头分子p-38、p44/42的表达及其磷酸化水平的影响,以明确其调控该信号通路的分子机制。结果巨噬细胞-GBS^(WI)组与巨噬细胞-GBS^(ΔcyIE)组相比,IL-10、TNF-α细胞因子上调,而IL-8、IL-12、NOS2细胞因子表达水平降低,表明无乳链球菌β溶血素CylE对细胞因子IL-10、TNF-α的影响结果一致,相对转录水平均上调,同时抑制细胞因子IL-8、IL-12及NOS2的转录。巨噬细胞-GBS;组与巨噬细胞-GBS;组相比,IL-10及TNF-α的相对表达量增加,而IL-8及IL-12的相对表达量下调,差异均具有统计学意义(均P>0.05),NOS2的相对表达量降低。对MAPK信号通路下游分子磷酸化检测结果显示,无乳链球菌β溶血素CylE基因可激活其下游接头分子p38磷酸化为p-p38,不能激活下游分子p44/42。结论根据上述结果,p38 MAPK是无乳链球菌溶血素CylE基因发挥免疫调控的识别途径,可能成为对其进行识别钝化,实现信号通路封闭,提高对牛乳腺炎预防与治疗有效性的新靶位,为有效防控该病原菌的危害,保障乳源安全提供新的思路和有效途径。 展开更多
关键词 牛乳腺炎 无乳链球菌 溶血素CylE基因 免疫调节
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