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基于CRISPR/Cas9系统的水稻光敏色素互作因子OsPIL15基因编辑 被引量：11
1
作者 季新 李飞 +6 位作者 晏云 孙红正 张静 李俊周 彭廷 杜彦修 赵全志 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第15期2861-2871,共11页
【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰... 【目的】光作为一种环境信号,可影响植物的基因表达、酶活性和形态建成。光敏色素互作因子在光信号传导过程中起着重要作用。本研究旨在构建水稻光敏色素互作因子OsPIL15的CRISPR/Cas9表达载体,创制OsPIL15突变体,挖掘水稻功能基因,丰富和完善水稻光信号调控分子机制。【方法】依据CRISPR/Cas9技术原理,设计OsPIL15突变靶点。将所设计靶序列在水稻基因组中进行比对,排除非特异性靶位点,同时使该靶序列含有常用酶切位点,方便后期突变体鉴定。化学合成靶位点寡核苷酸序列并与载体pBUN411连接构建CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,以除草剂抗性标记筛选获得阳性转基因植株。利用酶切法判断T0代转基因植株是否发生突变,结合测序结果分析突变单株的突变基因型。将靶点序列在水稻全基因组中进行比对分析,选择5个与靶序列同源性较高且错配在4 bp以内的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估,分析所设计靶序列特异性。【结果】所构建表达载体成功实现了对OsPIL15的定向编辑,酶切显示在选取的25株T0代转基因植株中获得15株突变体,其中包括5株纯合突变体、6株双等位突变体和4株杂合突变体,共10种不同突变基因型和11个突变株系。突变类型以单碱基插入或缺失为主,同时也得到2种56和66 bp较大片段缺失株系。对部分纯合突变、双等位突变和杂合突变体的T1代植株进行分析,结果表明,T0代产生的突变基因型绝大部分能稳定遗传给下一代。T0代纯合突变体后代为纯合突变单株,仅在株系14纯合突变体后代中检测到1株未突变单株;T0代双等位突变体后代可得到2种纯合突变型和1种双等位突变型;T0代杂合突变体后代则可得到纯合、杂合及未突变3种类型。对T0代未突变植株的后继世代酶切分析显示,62株T1代转基因植株均未发生突变,表� 展开更多
关键词 水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑 OsPIL15 脱靶效应
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基于RNAi技术的转基因植物监管现状及其面临的育种领域的挑战 被引量：6
2
作者 黄春蒙 朱鹏宇 +5 位作者 王智 王晨光 杜智欣 魏霜 张永江 付伟 《生物技术进展》 2020年第1期10-14,共5页
RNA干扰(RNA interference,RNAi)在植物、动物和真菌的生长、发育、病毒防御和转座子失活中起着至关重要的作用。目前已成功利用RNAi技术培育出抗病虫和品质改良等具有优良性状的生物技术产品,为农业绿色发展提供了强有力的支撑。然而,... RNA干扰(RNA interference,RNAi)在植物、动物和真菌的生长、发育、病毒防御和转座子失活中起着至关重要的作用。目前已成功利用RNAi技术培育出抗病虫和品质改良等具有优良性状的生物技术产品,为农业绿色发展提供了强有力的支撑。然而,目前RNAi的相关机制尚未完全明确,基于RNAi技术的转基因植物面临着一些亟待解决的问题,同时,对于RNAi转基因植物应用的安全高效监管也需进一步完善。基于此,对RNAi转基因植物的监管现状及其面临的育种上的挑战进行了综述,并对存在的问题提出了解决建议,以期为RNAi技术进一步应用于农业植物改良育种提供新思路,并为其监管评价提供依据。 展开更多
关键词 RNAi转基因植物 安全监管 脱靶效应 沉默效率 跨界调控
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基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究 被引量：4
3
作者 李继洋 胡燕 +2 位作者 姚瑞 代培红 刘晓东 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1522-1534,共13页
CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这... CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明,2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。 展开更多
关键词 棉花 CRISPR/Cas9 编辑效率 脱靶效率 sgRNA类型
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CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展 被引量：2
4
作者 程成 舒鹏程 彭小忠 《基础医学与临床》 CSCD 2018年第4期543-547,共5页
CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有... CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 脱靶效应 编辑效率
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CRISPR/Cas9基因编辑系统应用于非人灵长类细胞及胚胎Rb1基因编辑的研究 被引量：1
5
作者 怀思远 褚楚 +4 位作者 曹静 赵志飞 吴璇 冀天楠 李建雄 《解放军医学院学报》 CAS 2018年第8期707-712,共6页
目的探索聚簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对于食蟹猴细胞及胚胎基因组视网膜母细胞瘤抑癌基因(Rb1)的编辑效率,旨在进一步建立视网膜母细胞瘤模型。方法查阅RB1突变数据库(http://rb1-lsdb.d-lo... 目的探索聚簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)基因编辑系统对于食蟹猴细胞及胚胎基因组视网膜母细胞瘤抑癌基因(Rb1)的编辑效率,旨在进一步建立视网膜母细胞瘤模型。方法查阅RB1突变数据库(http://rb1-lsdb.d-lohmann.de),确定视母细胞瘤发生发展相关Rb1基因外显子区主要有8号外显子;利用DNAman检测人类与食蟹猴基因组中Rb1基因中与是否存在单核苷酸多态性(SNP);通过http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html设计并合成sgRNA;采用CRISPR/Cas9基因编辑系统转染食蟹猴成纤维细胞,并提取转染后细胞基因组以检测合成的sgRNA敲除效率;酶切实验检测转染的细胞是否发生突变,并利用单克隆分析测定具体敲除效率。进一步利用显微操作技术注射sgRNA和Cas9 nuclease混合物(RNP)入单细胞胚胎,检测胚胎水平Rb1基因编辑效率。结果 RNP转染后的食蟹猴成纤维细胞提取基因组检测,发现其中有75%的细胞发生基因突变,且基因编辑类型多样,以碱基缺失突变为主;在胚胎水平上获取4-细胞期胚胎,检测单个卵裂球基因组序列发现,存在突变的胚胎占所有胚胎的36.4%,其中纯合突变比例为18.2%,嵌合突变比例同为18.2%。利用软件预测脱靶位点12个,进行序列测定,结果未发现脱靶。结论在非人灵长类细胞及胚胎水平上,CRISPR/Cas9基因编辑系统对于食蟹猴Rb1基因编辑有效,并且敲除效率较高,进一步利用基因编辑方法建立视网膜母细胞瘤模型研究中,可以作为有效的基因编辑手段。本研究得到的食蟹猴胚胎Rb1基因的编辑效率及胚胎囊胚率为建立视网膜母细胞瘤模型提供了参考。 展开更多
关键词 视网膜母细胞瘤 聚簇规则间隔短回文重复序列/相关核酸酶9 基因敲除 打靶效率 脱靶效率
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