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外源蛋白表达系统及其应用的研究进展 被引量:12
1
作者 李航 戚睿斌 +2 位作者 陈宗艳 刘光清 李传峰 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第7期34-37,47,共5页
外源蛋白表达技术可用于如蛋白质间相互作用分析、基因调控分析、蛋白质结构及功能分析等多种下游应用。在考虑重组蛋白功能性、可溶性、生产速度及得率等因素下,正确选择蛋白表达系统和调控元件对试验能否成功具有重要意义。文章综述... 外源蛋白表达技术可用于如蛋白质间相互作用分析、基因调控分析、蛋白质结构及功能分析等多种下游应用。在考虑重组蛋白功能性、可溶性、生产速度及得率等因素下,正确选择蛋白表达系统和调控元件对试验能否成功具有重要意义。文章综述了常用的原核表达系统和真核表达系统及其优化和应用,以期为科研人员的研究和生产提供一定的技术支持。 展开更多
关键词 外源蛋白 原核表达 真核表达 蛋白表达优化 应用
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持续高糖状态对Kv11.1离子通道蛋白表达的影响
2
作者 韩稳琦 王毅 +3 位作者 陈海潮 尤红俊 邓纪钊 祁杰 《陕西医学杂志》 CAS 2024年第1期32-36,共5页
目的:探讨持续高浓度葡萄糖干预对Kv11.1离子通道蛋白表达的影响。方法:①采用双酶切法和基因重建技术将HERG基因插入到表达绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,构建Kv11.1离子通道蛋白的表达载体pEGFP-N1-HERG并测序验证。②pEGFP-N... 目的:探讨持续高浓度葡萄糖干预对Kv11.1离子通道蛋白表达的影响。方法:①采用双酶切法和基因重建技术将HERG基因插入到表达绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,构建Kv11.1离子通道蛋白的表达载体pEGFP-N1-HERG并测序验证。②pEGFP-N1-HERG表达载体鉴定成功后经脂质体转染HEK293T细胞,并通过不同糖浓度(5、17.5、30mmol/L)干预细胞48h后流式细胞仪检测细胞HERG离子通道蛋白绿色荧光平均表达量。结果:流式细胞仪检测pEGFP-N1-HERG融合蛋白平均荧光强度于不同浓度葡萄糖持续干预后分别为218.87(5mmol/L)、174.83(17.5mmol/L)、142.90(30mmol/L),三组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:持续高糖状态抑制Kv11.1离子通道蛋白的表达,为糖尿病患者长期高糖状态时QT间期延长提供理论依据并奠定实验基础。 展开更多
关键词 HERG基因 真核表达载体 高糖干预 Kv11.1 蛋白表达
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The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins 被引量:4
3
作者 Yuan He Kan Wang Nieng Yan 《Protein & Cell》 SCIE CAS CSCD 2014年第9期658-672,共15页
Eukaryotic membrane proteins, many of which are key players in various biological processes, constitute more than half of the drug targets and represent important candidates for structural studies. In contrast to thei... Eukaryotic membrane proteins, many of which are key players in various biological processes, constitute more than half of the drug targets and represent important candidates for structural studies. In contrast to their physiological significance, only very limited number of eukaryoUc membrane protein structures have been obtained due to the technical challenges in the genera- tion of recombinant proteins. In this review, we examine the major recombinant expression systems for eukaryotic membrane proteins and compare their relative advantages and disadvantages. We also attempted to summarize the recent technical strategies in the advancement of eukaryotic membrane protein purification and crystallization. 展开更多
关键词 eukaryotic membrane proteins recombinant expression structural biology integralmembrane proteins (IMPs) fluorescence detected sizeexclusion chromatography (FSEC) protein purification and crystallization
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PEDV Nsp10基因真核表达载体的构建及蛋白的表达
4
作者 牛欣雨 郑亮 +4 位作者 魏佳琪 武峰峰 吴志军 张华 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2023年第4期74-80,共7页
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。Nsp10是PEDV编码的一种非结构蛋白,在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时Nsp10蛋白发挥... 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)为猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。Nsp10是PEDV编码的一种非结构蛋白,在病毒的复制过程中发挥着重要的作用。为研究在病毒侵染宿主细胞时Nsp10蛋白发挥的作用,通过RT-PCR技术扩增Nsp10基因片段,利用同源重组的方法将Nsp10基因连接到pCMV-Myc载体,成功构建了PEDV Nsp10基因的真核表达载体。酶切鉴定及测序结果证实,PEDV Nsp10基因成功克隆到pCMV-Myc载体中,并将重组质粒命名为pCMV-Myc-Nsp10。将重组质粒pCMV-Myc-Nsp10通过脂质体转染至IPEC-J2细胞中,利用Western Blot和间接免疫荧光技术检测pCMV-Myc-Nsp10的表达以及定位情况。结果显示,pCMV-Myc-Nsp10在IPEC-J2细胞中成功表达,并且均匀分布在细胞质和细胞核中,为后续研究PEDV Nsp10蛋白的生物学功奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 真核表达载体 Nsp10蛋白 蛋白表达
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猪流行性腹泻病毒非结构蛋白Nsp14真核表达载体构建及蛋白表达鉴定
5
作者 武峰峰 高振秋 +5 位作者 郑亮 牛欣雨 魏佳琪 吴志军 张华 曹宏伟 《黑龙江八一农垦大学学报》 2023年第5期72-77,共6页
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp14蛋白是PEDV的一种非结构蛋白,由于它同时具有核酸外切酶活性和N7-甲基转移酶活性,在病毒的生命周期中发挥重要作用。为了对PEDV Nsp14蛋白进行更加深入的研究,从病变猪小... 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp14蛋白是PEDV的一种非结构蛋白,由于它同时具有核酸外切酶活性和N7-甲基转移酶活性,在病毒的生命周期中发挥重要作用。为了对PEDV Nsp14蛋白进行更加深入的研究,从病变猪小肠中提取总RNA,并通过PCR扩增获取PEDV Nsp14基因,经过双酶切与连接试验,最终将其连接到PRK5-Myc载体上。通过构建PEDV Nsp14真核重组表达载体,并通过Western Blot技术和免疫荧光技术在真核细胞中验证其蛋白表达情况和细胞内定位情况,为后续研究PEDV Nsp14蛋白的功能奠定研究基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 Nsp14 真核表达载体 蛋白表达
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BMP_2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性 被引量:3
6
作者 张银刚 郭雄 +2 位作者 师常宏 邹爱民 许鹏 《中南大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期16-20,共5页
目的:构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法: 用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS 7细 胞,用荧光显微镜检测和Westernblotting... 目的:构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并检测其表达的融合蛋白的生物活性。方法: 用基因重组技术构建BMP2/pLEGFP重组逆转录病毒表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染COS 7细 胞,用荧光显微镜检测和Westernblotting分析其在COS 7细胞表达,细胞活性实验和动物体内异位成骨实验进一 步检测融合蛋白的生物活性。结果:经酶切和PCR鉴定重组质粒BMP2/pLEGFP构建成功。转染COS 7细胞后, 荧光显微镜和Westernblotting检测均显示融合蛋白在细胞中表达;分泌的产物经细胞活性实验和动物体内异位成 骨实验证实具有BMP2和EGFP的双重蛋白活性。结论:基因重组技术成功构建BMP2/pLEGFP重组体,重组体表 达的融合蛋白具有GFP和BMP2的双重活性。 展开更多
关键词 BMP2 基因转染 真核表达 生物活性
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人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体的构建及表达 被引量:2
7
作者 黄卫东 郭嘉义 《宁夏医科大学学报》 2010年第1期18-21,F0003,共5页
目的构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将... 目的构建人类错配修复基因hMLH1和hMSH2错义突变真核表达载体并检测它们在瞬时转染细胞中的蛋白表达。方法重组pcDNA3.1-hMLH1-wt和pcDNA3.1-hMSH2-wt质粒为模板,用定点诱变的方法分别构建hMLH1基因和hMSH2基因错义突变真核表达载体,将诱变前后的重组质粒瞬时转染至HCT-116细胞(hMLH1基因缺陷型)或LoVo细胞(hMSH2基因缺陷型)中,免疫印迹法和免疫荧光法分别检测这两种基因在各自的转染细胞中的蛋白表达。结果测序证实,定点突变成功,构建出hMLH1基因错义突变pcDNA3.1-hMLH1-T117M和pcDNA3.1-hMLH1-V384D真核表达载体以及hMSH2基因错义突变pcDNA3.1-hMSH2-L390F、pcDNA3.1-hMSH2-Q419K和pcDNA3.1-hMSH2-Q629R真核表达载体。结果表明转染后,除hMLH1-T117M突变体蛋白表达缺失外,其余的野生型及突变型真核表达载体在转染细胞中均能表达相应的蛋白。结论成功构建了在人的肿瘤细胞系中能有效表达的两种hMLH1基因错义突变和三种hMSH2基因错义突变的真核表达载体,为进一步研究这些错义突变的病因学作用和功能意义奠定了实验基础。 展开更多
关键词 HMLH1 hMSH2错义突变 定点突变 真核表达载体 转染 蛋白表达
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重组人血小板CD36基因真核表达载体的构建及蛋白表达 被引量:2
8
作者 付丽辉 张杰 +7 位作者 孙春昀 陈麟凤 冯倩 罗圆圆 张晓娟 王可 于洋 汪德清 《中国输血杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期557-560,共4页
目的制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的纯化表达蛋白胞外区30~439氨基酸残基段。方法提取人肝细胞组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30~Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆... 目的制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的纯化表达蛋白胞外区30~439氨基酸残基段。方法提取人肝细胞组织总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30~Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 his真核瞬时表达载体。采用lipofectamine 2000(invitrogen)转染法,将重组质粒转染HEK-293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化。结果 RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段。invitrogen测序,该序列分析结果与Genebank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK-293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。结论利用构建的真核载体pTE2-s-CD36转染人胚肾细胞(HEK293)可高效表达CD36 Gly30~Asn439,得到纯化蛋白,为人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效影响的深入研究奠定基础。 展开更多
关键词 CD36抗原 血小板 真核载体 蛋白表达
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EG14-3-3真核表达蛋白的纯化及空间结构的生物信息学预测 被引量:1
9
作者 赵商岐 郑佳 +5 位作者 李艳敏 张传山 贾海英 龚巧巧 林仁勇 周晓涛 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第5期532-536,共5页
目的构建真核表达载体pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his,经表达、纯化后获得融合蛋白EG14-3-3-myc-his,并通过生物信息学预测EG14-3-3蛋白的空间结构。方法以pet41a-EG14-3-3为模板PCR扩增EG14-3-3基因的CDS区,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ... 目的构建真核表达载体pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his,经表达、纯化后获得融合蛋白EG14-3-3-myc-his,并通过生物信息学预测EG14-3-3蛋白的空间结构。方法以pet41a-EG14-3-3为模板PCR扩增EG14-3-3基因的CDS区,经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his A(-)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his。将质粒转染入293T细胞中表达EG14-3-3-myc-his蛋白,经亲和层析纯化后进行Western blot鉴定,通过在线网站对EG14-3-3蛋白空间结构进行生物信息学预测。结果成功构建pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his真核表达质粒,表达产物纯化后经SDS-PAGE电泳分析其分子质量为27.9 ku,与预期一致,且以第3次(4℃过夜)洗涤的靶蛋白含量较高。Western blot检测纯化后带有His标签的重组蛋白EG14-3-3-myc-his能被His单克隆抗体识别。生物信息学预测EG14-3-3蛋白无信号肽和跨膜区,其二级结构中的N端为无规则卷曲,之后紧连两个α螺旋,C末端为无规则卷曲和较短的片层结构。结论成功构建了pcDNA3.1-EG14-3-3-myc-his真核表达载体,通过蛋白纯化技术获得高纯度的蛋白。表达的EG14-3-3蛋白含有无规则卷曲,可能为抗原表位所在位置,为进一步研究14-3-3蛋白的功能及应用奠定了实验基础。 展开更多
关键词 细粒棘球蚴 EG14-3-3 真核蛋白表达 生物信息学预测
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喉癌来源黑色素瘤抗原A3在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达
10
作者 李宁 吉晓滨 +1 位作者 谢景华 刘启才 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期1517-1522,共6页
目的:建立pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤B16细胞稳定表达的肿瘤细胞模型。方法:将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3,脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3... 目的:建立pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤B16细胞稳定表达的肿瘤细胞模型。方法:将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(Melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3)构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3,脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,荧光定量PCR(qRT-PCR)检查MAGE-A3在B16细胞中的转录。结果:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光,qRT-PCR可检测到MAGE-A3 mRNA的转录。结论:pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒通过脂质体法能有效转染,并在B16稳定表达,成功建立了MAGE-A3肿瘤细胞模型。 展开更多
关键词 黑色素瘤抗原A 真核载体 基因转染 绿色荧光蛋白 基因表达 肿瘤细胞模型
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Neurexin 1β及其剪切变异体真核表达载体构建
11
作者 徐岩 侯筱宇 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-5,共5页
[目的]构建大鼠Neurexin 1β(Nrx 1β)及其剪切变异体Nrx 1β(ΔS4)真核表达载体,并鉴定其在真核细胞中的表达能力。[方法]以提取的大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)目的基因,通过分子生物学方法将目的基... [目的]构建大鼠Neurexin 1β(Nrx 1β)及其剪切变异体Nrx 1β(ΔS4)真核表达载体,并鉴定其在真核细胞中的表达能力。[方法]以提取的大鼠海马总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)目的基因,通过分子生物学方法将目的基因亚克隆至p DsRed2-C1载体。重组体转染HEK293T细胞,免疫印迹检测Nrx 1β及Nrx1β(ΔS4)的蛋白表达。[结果]Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)目的基因扩增成功,重组体酶切鉴定能观察到目的基因片段(约1500 bp处),Nrx 1β及Nrx 1β(ΔS4)测序结果与Gen Bank中的序列一致。免疫印迹显示,p DsRed2-C1-Myc-Nrx 1β或p DsRed2-C1-Myc-Nrx 1β(ΔS4)在HEK293T细胞中能表达Nrx 1β或Nrx 1β(ΔS4)。[结论]成功构建大鼠Nrx1β及其剪切变异体Nrx 1β(ΔS4)的真核表达载体,重组体在HEK293T细胞中高效表达。 展开更多
关键词 NEUREXIN 剪切变异体 真核表达载体 蛋白表达
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活化型及失活型n-Src真核表达载体的构建及活性鉴定
12
作者 杜彩萍 侯筱宇 《徐州医学院学报》 CAS 2014年第1期8-11,共4页
目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型(aSrc,SrcY535F)及失活型(iSrc,SrcK303R)真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活... 目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型(aSrc,SrcY535F)及失活型(iSrc,SrcK303R)真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活型pRc/CMV-n-Src全长序列,并转染入HEK293T细胞,通过免疫印迹检测n-Src的蛋白表达及其自身磷酸化水平.结果 aSrc及iSrc目的 基因成功扩增,且测序结果与预期结果一致.免疫印迹分析显示,aSrc及iSrc均能在HEK293T细胞中表达,aSrc自身磷酸化水平显著升高.结论 成功构建活化型及失活型n-Src真核表达载体,并能于HEK293T细胞中高效表达. 展开更多
关键词 n-Src 活化型 失活型 真核表达载体 蛋白表达
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宿主细胞干扰素刺激基因15蛋白的真核表达及初步应用
13
作者 王改丽 王建科 +4 位作者 孙娜 王超 易立 张淑琴 程世鹏 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第5期30-33,149,共5页
为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-... 为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 ISG15 真核表达 转染 蛋白表达
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鼠抗人血小板CD36分子单克隆抗体的制备及活性分析
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作者 陈麟凤 张杰 +5 位作者 杨嘉慧 罗圆圆 庄远 李卉 冯倩 汪德清 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期209-213,共5页
本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体。提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30-Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组... 本研究旨在制备具有功能活性的重组人血小板表面CD36抗原的鼠抗人单克隆抗体。提取人肝细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人血小板CD36抗原胞外区(Gly30-Asn439)氨基酸残基cDNA,构建于原核表达载体pMD18并转化大肠杆菌DH5α,筛选获得阳性重组子pMD18-CD36,提取质粒。经序列测定后,将该基因插入到真核细胞瞬时表达载体pTE2上,构建成为pTE2-s-CD36-10 His真核瞬时表达载体。采用lipofectamine 2000转染法,将重组质粒转染至HEK293细胞,表达产物经Ni2+2NTA柱层析纯化。以制备的重组CD36蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出阳性克隆,行Western blot检测抗体结合活性。结果显示:RT-PCR扩增获得了1.4 kb的片段。经测序,该序列分析结果与GenBank中的NM_001001547.2完全一致。SDS-PAGE证实转染的HEK293细胞表达了人CD36抗原胞外区蛋白片段。鼠单克隆抗体在Western blot中可以识别重组CD36蛋白,灵敏度达到8 ng。结论:成功制备了抗人血小板CD36单克隆抗体,为临床筛选CD36阴性患者及献血员、深入研究人血小板CD36表面抗原对血小板输注无效的影响提供了实验基础。 展开更多
关键词 CD36抗原 血小板输注无效 真核载体 蛋白表达
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大鼠STIM1基因真核表达载体构建及蛋白表达定位
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作者 庞春秀 林德馨 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期113-118,共6页
[目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋... [目的]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞中表达、定位。[方法]应用基因合成方法获得STIM1基因序列,克隆至携带EGFP标签的真核表达载体p EGFP-C_1、p IRES_2-EGFP,经菌落PCR、酶切、测序鉴定后,转染至A7r5细胞,Western Blot检测蛋白表达,激光共聚焦观察其定位。[结果]STIM1全长2 058 bp,重组载体经酶切、PCR、测序鉴定构建正确,在A7r5细胞内高表达,并主要定位于细胞质。[结论]构建大鼠STIM1基因重组质粒并在A7r5细胞质中表达,为建立稳定高表达细胞系及后续功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 STIM1 真核载体 蛋白表达 A7r5细胞
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HIV-1 CRF01_AE重组型gp120 V1/V2结构域单克隆抗体的制备与鉴定 被引量:4
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作者 楚鹰 宫祥丹 +5 位作者 高建伟 苏艾荣 陈德燕 宋红勇 吴喜林 吴稚伟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期540-545,共6页
目的真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性。方法构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠... 目的真核表达人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE重组型gp120蛋白的V1/V2结构域,制备其单克隆抗体并鉴定其抗原反应性。方法构建pTriEx-3-V1/V2CNE55真核表达载体,在HEK293F细胞中表达V1/V2-His融合蛋白,纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选分泌抗V1/V2重组蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤,对单克隆抗体的特异性、型别以及效价进行鉴定。结果制备并获得一株稳定分泌抗HIV-1 AE亚型V1/V2结构域单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定腹水效价高达1∶81 000,单克隆抗体类型属于IgG1/κ型。Western blot结果表明该单克隆抗体同样能够识别不同亚型的HIV gp120蛋白。结论成功制备出抗HIV-1 AE重组型gp120蛋白V1/V2结构域的单克隆抗体。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) gp120可变区1/2 单克隆抗体 真核蛋白表达 疫苗
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葡萄球菌肠毒素A基因真核表达系统的构建及其目的重组蛋白的鉴定(英文)
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作者 孙爱华 邵浙新 +2 位作者 阮萍 毛亚飞 严杰 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2004年第4期303-306,310,共5页
目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法 采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC135 6 5菌株中扩增全长SEA ,目的扩增片段T -A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒 pUCm -T -SEA... 目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因、构建其真核表达系统及目的重组蛋白的表达情况。方法 采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC135 6 5菌株中扩增全长SEA ,目的扩增片段T -A克隆后测序。经核酸内切酶酶切重组质粒 pUCm -T -SEA获得的 pUCm -T -SEA基因片段与真核表达载体 pPIC9K连接。采用电融合法将重组真核载体pPIC9K -SEA转化入P pastorisGS115株 ,构建成真核表达系统 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。采用含G4 18抑制剂的YPD琼脂平板和PCR筛选并鉴定 pPIC9K -SEA -P pastorisGS115。 0 5 % (V∶V)甲醇诱导下 ,采用SDS -PAGE检查BMMY液体培养基上清中重组SEA(rSEA)的表达情况。结果 可从S aureusATCC135 6 5株DNA中扩增获得SEA目的片段。与报道的SEA基因序列 (GenBankNo :AP0 0 4 82 8andL2 2 5 6 6 )比较 ,所克隆的SEA基因核苷酸及氨基酸序列的相似性分别高达 98 84 %~ 10 0 %和 10 0 %。在甲醇的诱导下 ,pPIC9K -SEA -P pastorisGS115能表达在SDS -PAGE图谱位于预期位置的rSEA。结论 我们成功地构建了能表达SEA的真核表达系统 ,为进一步分析SEA分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。 展开更多
关键词 葡萄球菌肠毒素A 基因 真核表达系统 构建 重组蛋白 鉴定
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Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
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作者 游莎 曾和松 《微循环学杂志》 2010年第1期25-28,F0003,共5页
目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP... 目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P<0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P<0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。 展开更多
关键词 SALUSIN 基因真核表达载体 HEK293细胞 生物活性肽 生长相关基因 生物信息学 氨基酸残基
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信号肽及其在蛋白质表达中的应用 被引量:64
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作者 韦雪芳 王冬梅 +1 位作者 刘思 周鹏 《生物技术通报》 CAS CSCD 2006年第6期38-42,共5页
分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐... 分子生物学研究已进入后基因组时代,其中心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构和功能。由于基因功能最终通过其表达产物——蛋白质来实现,因此,要了解基因组全部功能活动,最终也必须回到蛋白质上。另外,在菌株、培养和发酵等逐渐成熟的条件下,构建高效的表达载体以提高外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。随着研究的深入,发现信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用,使得信号肽的研究不仅具有重要的理论意义,而且也具有潜在的应用价值。就信号肽的结构和功能,信号肽的捕获方法及其在原核表达系统和真核表达系统中表达外源蛋白质的应用做一些介绍。 展开更多
关键词 信号肽 捕获 原核表达系统 真核表达系统 蛋白质表达
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