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黑色素瘤相关抗原MAAT1p15与LRP6的相互作用及其对Wnt信号通路的调控 被引量:10
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作者 韩亮 张新军 +2 位作者 黄世思 翟永功 常智杰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期827-832,共6页
为了深入研究Wnt信号的传导机制 ,利用GAL4酵母双杂交系统 ,以Wnt受体LRP6的胞内区为诱饵蛋白 ,筛选小鼠 11 5d胚胎cDNA文库 ,发现了一个新的LRP6相互作用蛋白 :黑色素瘤相关抗原MAAT1p15 (melanoma associatedantigenrecognizedbycytot... 为了深入研究Wnt信号的传导机制 ,利用GAL4酵母双杂交系统 ,以Wnt受体LRP6的胞内区为诱饵蛋白 ,筛选小鼠 11 5d胚胎cDNA文库 ,发现了一个新的LRP6相互作用蛋白 :黑色素瘤相关抗原MAAT1p15 (melanoma associatedantigenrecognizedbycytotoxicTlymphocytesp15 ) .免疫共沉淀方法证明了LRP6胞内区和MAAT1p15在哺乳动物细胞中也存在相互作用 .荧光素酶报告系统分析实验显示 ,MAAT1p15能够明显增强Wnt1和LRP6响应的下游基因的转录活性 。 展开更多
关键词 WNT RP6 MAAT1 P15 酵母双杂交 免疫共沉淀 荧光素酶报告系统
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PC-1基因在肿瘤组织中的表达及其启动子区的克隆和活性分析 被引量:11
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作者 王健 周建光 +3 位作者 李杰之 张浩 陈珊 黄翠芬 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第11期1187-1191,共5页
背景与目的:PC-1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4-2中高表达的新基因。本文拟研究PC-1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法:以PC-1基因特异性DNA序列为探针与10对肿... 背景与目的:PC-1是在骨转移和雄激素非依赖的前列腺癌细胞株C4-2中高表达的新基因。本文拟研究PC-1基因在多种人肿瘤组织和正常组织中的表达水平,并对该基因的启动子区进行克隆及活性分析。方法:以PC-1基因特异性DNA序列为探针与10对肿瘤和正常组织的总RNA进行杂交;以C4-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增PC-1基因翻译起始位点上游DNA序列。PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic上,将重组质粒瞬时转染C4-2细胞,荧光素酶定量分析检测启动子活性。结果:多种肿瘤组织中PC-1基因的表达水平明显高于相应的正常组织中的表达;翻译起始位点上游340bp的片段没有启动子活性,而ATG前1099bp、1337bp、1579bp、1831bp和4939bp长度的片段都表现出启动子的功能活性。结论:PC-1基因在人前列腺癌以及多种肿瘤组织中被特异激活,表明该基因的功能可能和肿瘤的发生有关;研究的初步结果表明4939bp长度的启动子活性最强,在1831bp和4939bp之间可能含有转录增强子元件。 展开更多
关键词 前列腺癌 PC-1基因 基因表达 启动子 荧光素酶分析
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长链非编码RNA的微RNA海绵作用与呼吸系统疾病 被引量:7
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作者 武丹 曾林祥 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期499-503,共5页
长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类由长度大于200个核苷酸组成的长链非编码序列。lncRNAs具有较长的序列,使得lncRNAs具有复杂的二级及三级结构,这也是lncRNAs结合DNA、RNA和蛋白质及其行使复杂功能的结构基础。MicroR... 长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类由长度大于200个核苷酸组成的长链非编码序列。lncRNAs具有较长的序列,使得lncRNAs具有复杂的二级及三级结构,这也是lncRNAs结合DNA、RNA和蛋白质及其行使复杂功能的结构基础。MicroRNA(miRNAs)是长度在19到25个核苷酸之间的非编码单链RNA分子,是目前研究最多的小分子非编码RNA。而lncRNAs通过结合或者螯合miRNA来调节miRNA丰度,发挥lncRNA的"海绵"作用,从而调控一系列的病理生理过程。lncRNAs及miRNA在呼吸系统疾病的发生、发展、治疗和预后起重要作用。本文就lncRNAs及其"海绵"作用对呼吸系统疾病的影响及可能的机制进行综述。 展开更多
关键词 长链非编码RNA 海绵 微RNA 呼吸系统疾病 荧光素酶测定
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SRY基因启动子不同模块的克隆及功能分析 被引量:2
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作者 袁灿 朱敏 +1 位作者 刘智 谢慎思 《湖南医科大学学报》 CSCD 2000年第3期227-230,共4页
采用报告基因分析的方法 ,构建SRY基因 5′旁侧具有启动效应的 5 44bp以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体PGL2 Enhancer的重组子 ,并通过脂质体转染技术导入Hela细胞 ,检测各重组子报告基因的瞬间表达 ,由此分析启动子不同模块对... 采用报告基因分析的方法 ,构建SRY基因 5′旁侧具有启动效应的 5 44bp以内不同长度片段与荧光素酶报告基因载体PGL2 Enhancer的重组子 ,并通过脂质体转染技术导入Hela细胞 ,检测各重组子报告基因的瞬间表达 ,由此分析启动子不同模块对基因转录效率的影响。结果显示 :位于起始密码子ATG上游nt.- 35 3~ - 174之间的 179bp片段内含有某种抑制子元件 ,nt.- 112~ - 6 3之间的 49bp片段内含有某种增强子元件 ,nt.- 174~ - 112之间的 6 3bp片段中含有基因转录所必须的启动子序列。进一步定位这些顺式作用元件 ,并研究与之相互作用的反式作用因子 。 展开更多
关键词 SRY基因 启动子 克隆 基因调控
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hTERT转录调控区克隆及在人癌细胞的转录特异性分析 被引量:4
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作者 杨邵敏 张波 +1 位作者 廖松林 侯琳 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期470-474,共5页
目的 通过克隆人癌细胞中端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因上游转录调控区并观察其在不同人癌细胞和正常细胞中的转录活性 ,探讨人hTERT基因在细胞癌变中的激活机制。方法 用PCR方法克隆HeLa和PG癌细胞hTERT基因转录调控区 ,并进行DNA序列... 目的 通过克隆人癌细胞中端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因上游转录调控区并观察其在不同人癌细胞和正常细胞中的转录活性 ,探讨人hTERT基因在细胞癌变中的激活机制。方法 用PCR方法克隆HeLa和PG癌细胞hTERT基因转录调控区 ,并进行DNA序列测定 ;将转录调控区重组于荧光酶报告载体 ,瞬时转染人癌细胞HeLa、PG、2 93和正常人二倍体细胞 2BS后 ,测定荧光酶活性以确定调控区转录活性。结果 于人HeLa和PG癌细胞分别克隆hTERT基因转录起始点附近 6 36bp(- 5 31~ +90 )和 95 0bp(- 5 31~ +40 4 )的转录调节区 ,其序列与GenBank人hTERT启动子序列相同。将两转录调控区分别重组于荧光酶报告载体pGL2 ,得到pGL2 6 36和pGL2 95 0 ,并同时构建了pGL2 X(- 5 31~ - 2 72 )和pGL2 S (第一内含子区 )。瞬时转染细胞后发现 :pGL2 6 36和pGL2 95 0在癌细胞中的转录活性明显增高 ,而在人二倍体 2BS细胞中几无转录活性。重组体pGL2 S和pGL2 X在端粒酶阳性肿瘤细胞中的转录活性明显降低 ,pGL2 S的转录活性略高于pGL2 X。结论 人HeLa和PG癌细胞中hTERT转录调控区无基因突变并高度保存 ;hTERT调控区具有癌细胞特异性转录调节活性 ,表明hTERT转录水平的激活与端粒酶阳性及细胞癌变密切相关 ;hTERT上游 2 展开更多
关键词 人端粒酶逆转录酶 荧光酶分析法 基因调控 基因克隆
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黄芩苷对SARS-COV-2侵袭的抑制作用研究 被引量:1
6
作者 耿雪 王雪 +3 位作者 周倩 苏昕宇 李水仙 祝清芬 《药学研究》 CAS 2024年第4期333-337,共5页
目的在体外研究黄芩苷对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)入侵细胞过程的抑制作用。方法利用构建有荧光素酶报告基因的SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系统,通过荧光素酶试剂盒检测加入黄芩苷和假病毒后Huh-7细胞中的荧光素表达变化,进而绘制病毒抑制... 目的在体外研究黄芩苷对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)入侵细胞过程的抑制作用。方法利用构建有荧光素酶报告基因的SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系统,通过荧光素酶试剂盒检测加入黄芩苷和假病毒后Huh-7细胞中的荧光素表达变化,进而绘制病毒抑制曲线。结果黄芩苷能显著抑制Huh-7细胞的病毒感染率,黄芩苷和病毒提前共孵育组与直接加入组在不同浓度下的病毒抑制曲线并无显著差别,表明黄芩苷并不能与病毒直接结合,而是通过作用于病毒S蛋白介导的细胞融合过程产生抑制作用;黄芩苷在0.125 mg·mL^(-1)浓度时,对病毒的抑制率在4 h组显著降低,在0 h和2 h组并无显著差别,表明黄芩苷可能在病毒入侵细胞(非吸附)阶段产生抑制作用,且介导的入侵抑制阶段发生在4 h内。结论黄芩苷可能通过介导抑制SARS-CoV-2病毒S蛋白与细胞表面受体的融合过程,在非吸附阶段抑制病毒的入侵,发挥抗新冠病毒活性。 展开更多
关键词 黄芩苷 新型冠状病毒 荧光素酶检测 SARS-CoV-2 S蛋白
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An antioxidant resveratrol significantly enhanced replication of hepatitis C virus 被引量:3
7
作者 Mitsuyasu Nakamura Masanori Ikeda +3 位作者 Ryota Hokari Nobuyuki Kato Toshifumi Hibi Soichiro Miura 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS CSCD 2010年第2期184-192,共9页
AIM:To elucidate the effect of antioxidants,resveratrol (RVT)and astaxanthin(AXN),on hepatitis C virus(HCV) replication. METHODS:We investigated the effect of recent popular antioxidant supplements on replication of t... AIM:To elucidate the effect of antioxidants,resveratrol (RVT)and astaxanthin(AXN),on hepatitis C virus(HCV) replication. METHODS:We investigated the effect of recent popular antioxidant supplements on replication of the HCV replicon system OR6.RVT is a strong antioxidant and a kind of polyphenol that inhibits replication of various viruses.AXN is also a strong antioxidant.The replication of HCV RNA was assessed by the luciferase reporter assay.An additive effect of antioxidants on antiviral effects of interferon(IFN)and ribavirin(RBV) was investigated.RESULTS:This is the first report to investigate the effect of RVT and AXN on HCV replication.In contrast to other reported viruses,RVT significantly enhanced HCV RNA replication.Vitamin E also enhanced HCV RNA replication as reported previously,although AXN didnot affect replication.IFN and RBV significantly reduced HCV RNA replication,but these effects were dose-dependently hampered and attenuated by the addition of RVT.AXN didnot affect antiviral effects of IFN or RBV. CONCLUSION:These results suggested that RVT is not suitable as an antioxidant therapy for chronic hepatitis C. 展开更多
关键词 Replicon system luciferase assay RIBAVIRIN INTERFERON POLYPHENOL ASTAXANTHIN
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家蚕BmN细胞中8种启动子的活性比较及利用hr5-IE1启动子实现EGFP的稳定表达 被引量:3
8
作者 王娜 杜希宽 +2 位作者 蒋明星 张传溪 程家安 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期279-285,共7页
为筛选出一个较强的启动子用于提高转座子piggyBac在家蚕Bombyx mori细胞中的转化效率,采用双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay)技术比较了热激蛋白启动子(hsp70和hsp82)、家蚕肌动蛋白启动子(A3)、多聚泛素(polyub... 为筛选出一个较强的启动子用于提高转座子piggyBac在家蚕Bombyx mori细胞中的转化效率,采用双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay)技术比较了热激蛋白启动子(hsp70和hsp82)、家蚕肌动蛋白启动子(A3)、多聚泛素(polyubiquitin)启动子(PUB)、α微管蛋白启动子(α-tub)、丝素轻链启动子(Fib-L)、人工合成启动子3×P3及苜蓿丫纹夜蛾多角体病毒(AcNPV)增强子-启动子组合(hr5-IE1)8种启动子在家蚕细胞株BmN内的活性。结果显示hr5-IE1活性最强,A3次之,其余启动子活性均较弱。构建含有hr5-IE1启动子和piggyBac的转座酶编码区的质粒作为辅助质粒,与EGFP载体质粒一起转染家蚕细胞后,实现了EGFP基因整合到细胞基因组中。因此,今后可考虑将hr5-IE1用于家蚕细胞遗传转化的研究中,以提高细胞转化的效率。 展开更多
关键词 家蚕 hr5-IE1 荧光素酶分析 PIGGYBAC 启动子 遗传转化
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miR-let-7c-5p对膀胱癌细胞恶性行为、血管管腔形成及HMGB2的调控作用
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作者 刘辉勇 董铮 +1 位作者 徐涛 柳琦 《检验医学与临床》 CAS 2024年第8期1035-1040,共6页
目的探讨miR-let-7c-5p对膀胱癌细胞恶性行为、血管管腔形成及高迁移率族蛋白(HMGB)2的调控作用。方法将人膀胱癌UM-UC-3细胞分别进行常规培养(空白组)、转染mimics-NC(mimics-NC组)、转染miR-let-7c-5p-mimics(miR-let-7c-5p-mimics组... 目的探讨miR-let-7c-5p对膀胱癌细胞恶性行为、血管管腔形成及高迁移率族蛋白(HMGB)2的调控作用。方法将人膀胱癌UM-UC-3细胞分别进行常规培养(空白组)、转染mimics-NC(mimics-NC组)、转染miR-let-7c-5p-mimics(miR-let-7c-5p-mimics组)、转染inhibitor-NC(inhibitor-NC组)及转染miR-let-7c-5p-inhibitor(miR-let-7c-5p-inhibitor组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞miR-let-7c-5p转染成功率;采用Transwell法检测各组细胞侵袭能力;采用划痕试验检测各组细胞迁移能力;采用Matrigel胶小管形成试验检测各组细胞血管生成;采用免疫印迹法检测各组细胞HMGB2、血管内皮生长因子(VEGF)及葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)蛋白表达水平;采用荧光素酶试验验证miR-let-7c-5p对HMGB2的调控作用。结果空白组、mimics-NC组及inhibitor-NC组miR-let-7c-5p mRNA表达水平、侵袭数目、划痕愈合率、血管管腔数目,HMGB2、VEGF及GLUT-1蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与空白组、mimics-NC组及inhibitor-NC组比较,miR-let-7c-5p-mimics组miR-let-7c-5p mRNA表达水平升高,侵袭数目、划痕愈合率、血管管腔数目,HMGB2、VEGF及GLUT-1蛋白表达水平均降低,miR-let-7c-5p-inhibitor组miR-let-7c-5p mRNA表达水平降低,侵袭数目、划痕愈合率、血管管腔数目,HMGB2、VEGF及GLUT-1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶试验结果显示,与mimics-NC组比较,miR-let-7c-5p-mimics组HMGB2-Wt水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论上调miR-let-7c-5p可明显抑制膀胱癌细胞侵袭、转移及血管生成,其机制与抑制HMGB2蛋白表达相关。 展开更多
关键词 膀胱癌 血管管腔 高迁移率族蛋白2 侵袭 转移 荧光素酶试验
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Functional analysis of the promoter of the dmrt1 gene in Chinese tongue sole,Cynoglossus semilaevis 被引量:2
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作者 WANG Qian CUI Zhongkai +4 位作者 GUO Hua ZHANG Nianwei XU Wenteng YANG Yingming CHEN Songlin 《Journal of Oceanology and Limnology》 SCIE CAS CSCD 2019年第4期1333-1341,共9页
The dmrt1 (doublesex and mab-3 related transcription factor 1) gene is considered to play an essential role in testis differentiation and development among metazoan species. As an economically important marine fish in... The dmrt1 (doublesex and mab-3 related transcription factor 1) gene is considered to play an essential role in testis differentiation and development among metazoan species. As an economically important marine fish in China, Chinese tongue sole (Cynoglossus semilaevis) possess a ZW/ZZ sex-determining system, and the females usually grow two to four times bigger than males. Previous studies have confirmed that Z-linked dmrt1 gene is the male determining gene in C. semilaevis and TALENs-mediated knocking-out individuals showed increased growth phenotype. In order to investigate the function of dmrt1 regulatory regions and its potential application, we have cloned the promoter of C. semilaevis dmrt1. The acquired sequence consisted of a 5'-upstream sequence and a partial exon1;functional analysis showed that there were two positive regulatory regions in the promoter, as well as one negative region and one neutral region. These positive regions were then combined to obtain several newly constructed promoters. Both in vitro and in vivo analysis confirmed one of them (dmrt1-Δ3+Δ4) showed elevated promoting activity compared to the full-length promoter and could drive exogenous gene expression in tongue sole gonads. Our results will provide useful information for understanding the regulatory mechanism of dmrt1 gene during C. semilaevis sex determination, and the endogenous promoter will facilitate the transgenic research for analyzing sex- and growth-related genes. 展开更多
关键词 Cynoglossus SEMILAEVIS DMRT1 PROMOTER transcription regulation luciferase assay GONAD
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柯萨奇病毒A组16型中和抗体假病毒荧光定量检测方法的建立及初步应用 被引量:3
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作者 郝晓甜 陈盼 +5 位作者 毛群颖 邵杰 林惠娟 罗震 吴星 梁争论 《中国病毒病杂志》 CAS 2016年第1期6-11,共6页
目的建立一种简单、快速、高通量的检测柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)中和抗体假病毒荧光定量检测方法 (pseudovirus luciferase assay,PVLA)。方法首先构建CV-A16核衣壳蛋白表达子及插入萤火虫荧光素酶报告基因的肠道病毒71型(EV-A71)复制... 目的建立一种简单、快速、高通量的检测柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)中和抗体假病毒荧光定量检测方法 (pseudovirus luciferase assay,PVLA)。方法首先构建CV-A16核衣壳蛋白表达子及插入萤火虫荧光素酶报告基因的肠道病毒71型(EV-A71)复制子,再顺次转染293T细胞,互补包装得到CVA16假病毒。通过条件优化并使用CV-A16国家中和抗体标准品,建立CV-A16中和抗体定量检测方法(PVLA)。用该方法检测15份CV-A16病毒免疫小鼠血清,并与传统CPE法的检测结果进行统计学分析,比较两种方法检测结果的一致性。结果得到CV-A16假病毒,建立了CV-A16假病毒中和抗体检测方法,该方法检测CV-A16中和抗体滴度的结果与传统CPE法的检测结果高度一致(相关系数r2为0.91)。结论CV-A16假病毒中和抗体检测方法可作为CPE法的替代方法,用于CV-A16中和抗体的快速检测。 展开更多
关键词 柯萨奇病毒A16型 假病毒 中和抗体 荧光定量
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序列特异的双链RNA可解除CHIP对TGF-β信号通路的抑制作用 被引量:2
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作者 徐夏莲 辛宏 +2 位作者 王春华 王银银 常智杰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期445-450,共6页
根据热休克蛋白Hsc70C端结合蛋白CHIP(carboxylterminusofHsc70 interactingprotein ,CHIP)cDNA上特异序列合成寡核苷酸片段 ,以pBS U6为载体 ,构建产生CHIPdsRNA (doublestrandedRNA ,dsRNA)的表达质粒pBS U6 CHIPi .免疫印迹和免疫... 根据热休克蛋白Hsc70C端结合蛋白CHIP(carboxylterminusofHsc70 interactingprotein ,CHIP)cDNA上特异序列合成寡核苷酸片段 ,以pBS U6为载体 ,构建产生CHIPdsRNA (doublestrandedRNA ,dsRNA)的表达质粒pBS U6 CHIPi .免疫印迹和免疫染色结果显示 ,pBS U6 CHIPi可以高效、特异地抑制哺乳动物细胞内CHIP基因的表达 .为进一步研究CHIP在TGF β信号通路中的调控作用 ,利用pBS U6 CHIPi从细胞水平上封闭CHIP基因表达 ,观察TGF β介导的基因转录活性的变化 .荧光素酶报告分析 (luciferaseassay)结果显示 ,CHIP明显抑制TGF β介导的下游基因的转录活性 ,而转染pBS U6 CHIPi能有效解除CHIP的抑制作用 ,从而提高TGF β信号通路转录水平 ,从逆向角度进一步验证了CHIP在TGF 展开更多
关键词 CHIP DSRNA 免疫印迹 免疫染色 荧光素酶报告分析(1uciferase assay)
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人SATB1基因5′上游序列的转录激活功能分析 被引量:1
13
作者 李颖 戴冰冰 +3 位作者 蔡蓉 仇全 于丽莉 卢健 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期221-226,共6页
在对人SATB1基因进行生物信息学分析的基础上 ,采用PCR技术 ,扩增人基因组DNA中SATB1基因 5′上游序列的 - 2 95 5~ - 9片段 ,构建了 3个分别由SATB1基因 5′上游 - 2 95 5~ - 9,- 172 7~ - 9和 - 76 0~ - 9序列片段驱动的报告载体 ... 在对人SATB1基因进行生物信息学分析的基础上 ,采用PCR技术 ,扩增人基因组DNA中SATB1基因 5′上游序列的 - 2 95 5~ - 9片段 ,构建了 3个分别由SATB1基因 5′上游 - 2 95 5~ - 9,- 172 7~ - 9和 - 76 0~ - 9序列片段驱动的报告载体 -pGL3 SP2 94 6 luc ,pGL3 SP1718 luc和pGL3 SP75 1 luc ,分别瞬时转染JurkatT ,K5 6 2 ,U937和HeLa细胞 ,通过测定荧光素酶的表达活性 ,观察SATB1基因 5′上游序列片段 3个删除突变体在不同细胞内活性的差异 .结果显示 ,SATB1上游序列- 2 95 5 - 9在 4种细胞中的转录激活能力为U937>JurkatT >K5 6 2 ,在HeLa细胞中基本无激活 ,提示SATB1的转录激活可能具有一定的细胞类型特异性 .3种 5′删除突变体转录激活性由大至小顺序为 - 76 0 - 9>- 2 95 5 - 9>- 172 7 - 9,提示SATB1的核心启动子可能存在于其 5′上游序列的- 76 0至 - 9bp区域中 . 展开更多
关键词 SATB1基因 启动子 报告基因分析 转录调控
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调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定 被引量:2
14
作者 李虹仪 习欠云 张永亮 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期35-40,共6页
肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接... 肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P<0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P>0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子Α MIRNA 荧光素酶
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KSR2基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p靶向关系验证 被引量:1
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作者 李池慧 陶然 +3 位作者 李华美 李伟 尚世强 张钧 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1410-1419,共10页
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的miR-UL70-3p和miR-US4-3p是HCMV microRNA(miRNA)家族中的一员,前期经生物信息学分析发现,Ras激酶抑制剂2(Kinase Suppressor 2 of Ras,KSR2)的3’-UTR区为miR-UL70-3p和miR-US4-3p的高度可... 人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)的miR-UL70-3p和miR-US4-3p是HCMV microRNA(miRNA)家族中的一员,前期经生物信息学分析发现,Ras激酶抑制剂2(Kinase Suppressor 2 of Ras,KSR2)的3’-UTR区为miR-UL70-3p和miR-US4-3p的高度可疑结合靶点。为进一步鉴定miR-UL70-3p和miR-US4-3p与KSR2基因的靶标关系,本研究通过构建GV272-KSR2-3’UTR野生和突变型载体,进行双荧光素酶(Luciferase)报告基因实验,并测定其荧光值活性的方法判定miR-UL70-3p和miR-US4-3p是否能与KSR2基因结合。先将293T细胞复苏、扩增并进行质粒转染,转染分6组,每组重复做3孔,分组分别为①KSR2-3’UTR阴性载体与miRNA无关序列载体②KSR2-3’UTR阴性载体与miRNA有效序列载体③KSR2-3’UTR野生序列载体与miRNA无关序列载体④KSR2-3’UTR野生序列载体与miRNA有效序列载体⑤ KSR2-3’UTR突变序列载体与miRNA无关序列载体⑥ KSR2-3’UTR突变序列载体与miRNA有效序列载体。酶切及DNA测序结果显示GV272-KSR2-3’UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功。Luciferase检测显示:同一Luciferase质粒转染的两个组中,将miRNA-NC组Luciferase相对表达量均一化为1,即将实验组①③⑤均一化为1后,比较实验组③和④组、⑤和⑥组、④和⑥组之间的Luciferase检测结果,显示实验组④和实验组③相比,有显著性降低(P<0.05),实验组⑥和实验组⑤相比,实验组⑥和实验组④相比,差异具有统计学意义(P<0.05),说明hcmv-miR-UL70-3p和hcmv-miR-US4-3p可与KSR2-3’UTR结合,抑制KSR2表达。 展开更多
关键词 人巨细胞病毒(HCMV) Ras激酶抑制剂2(KSR2)基因3’UTR hcmv-miR-UL70-3p hcmv-miR-US4-3p luciferase实验
原文传递
在神经干细胞中Sox2直接调节Olig2的转录活性 被引量:1
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作者 扈启宽 李美育 +2 位作者 李学国 徐方 孙涛 《宁夏医学杂志》 CAS 2009年第4期300-301,F0002,共3页
目的研究Sox2对Olig2直接转录调节。方法荧光素酶报告基因法(Luciferase assay)检测Sox2对Olig2基因启动子激活作用;染色质免疫共沉淀法(CHIP assay)验证体外培养的神经干细胞中Sox2与Olig2基因启动子DNA的结合位点。结果在神经干细胞中... 目的研究Sox2对Olig2直接转录调节。方法荧光素酶报告基因法(Luciferase assay)检测Sox2对Olig2基因启动子激活作用;染色质免疫共沉淀法(CHIP assay)验证体外培养的神经干细胞中Sox2与Olig2基因启动子DNA的结合位点。结果在神经干细胞中,Sox2转录因子与Olig2基因启动子DNA存在结合(-1232-977,ATG为+1),并能在体外激活Olig2的转录。结论Sox2可直接调节Olig2基因的转录活性,参与干细胞向少突胶质分化潜能的维持。 展开更多
关键词 SOX2 OLIG2 荧光素酶报告基因法 染色质免疫共沉淀
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鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体及突变型的构建及信号通路初探 被引量:1
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作者 闵天奇 贾琼 +8 位作者 韩蕊 苏语兮 嵇祝星 王泽源 刘敏 崔子鹤 张海洁 肖霞 王志强 《中国家禽》 北大核心 2019年第1期13-19,共7页
试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合... 试验旨在构建鸡、鸭、鹅黑素皮质素受体5(Melanocortin Receptor-5,MC5R)及其突变体的真核表达载体,并比较野生型与突变体MC5R在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达及功能的差异。从三种家禽血液中分别提取全基因组DNA,以其为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因编码区。用同源重组方法将扩增的目的基因片段定向插入表达载体pcDNA3.1(+)中。单点突变构建pcDNA3.1(+)-MC5Rs突变型。用脂质体法将三种禽类野生型和突变型重组质粒pcDNA3.1(+)-MC5Rs分别瞬时转染入HEK293T细胞中,用双萤光素酶报告基因法检测胞内第二信使cAMP水平的变化来反应受体的表达和激活情况。结果表明:成功构建了鸡、鸭、鹅MC5R真核表达载体与各3个突变型(D119A、F254A和H257A)。在HEK293T细胞中表达时,与野生型相比,F254A的基础活性大幅升高,D119A与H257A的基础活性变化不大;D119A与H257A对激动剂α-MSH的反应活性完全丧失,F254A对于激动剂α-MSH的反应活性降低,为进一步研究体外鸡、鸭、鹅MC5R功能奠定基础。 展开更多
关键词 MC5R 真核表达 报告基因检测
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大鼠SCN5A基因内含子1 +204 bp^+757 bp转录调控功能分析
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作者 刘宇 李晖 +4 位作者 董钦 张振明 李凤兰 李金波 马宁 《医学分子生物学杂志》 CAS CSCD 2007年第2期108-111,共4页
目的克隆大鼠心肌SCN5A基因5′端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法扩增大鼠心肌SCN5A基因+204 bp^+757 bp、+204 bp^+385 bp和+204 bp^+329 bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,... 目的克隆大鼠心肌SCN5A基因5′端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法扩增大鼠心肌SCN5A基因+204 bp^+757 bp、+204 bp^+385 bp和+204 bp^+329 bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性。结果成功构建大鼠心肌SCN5A基因5′端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-P0、pGL3-P2的4.3倍和2.8倍。结论SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因+329 bp^+385 bp为正调控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控。 展开更多
关键词 SCN5A基因 转录调控 报告基因分析 顺式作用元件
原文传递
过表达E2F6基因抑制BRD7基因启动子活性 被引量:1
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作者 刘华英 罗晓敏 +10 位作者 李夏雨 牛朝霞 张荔茗 周鸣 彭聪 向波 李征 彭淑平 李丹 李小玲 李桂源 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期886-893,共8页
BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程.前期工作已克隆了BRD7基因启动子区,并将其启动... BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达BRD7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程.前期工作已克隆了BRD7基因启动子区,并将其启动子定位于450bp(-404~+46bp)的区域.为了进一步揭示BRD7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,生物信息学分析表明,BRD7基因启动子-229至-243bp为一个E2F6转录因子结合位点共有序列,电泳迁移率实验结果表明转录因子E2F6特异性地结合于BRD7启动子区.荧光素酶检测和绿色荧光蛋白表达检测都证实,过表达E2F6基因能抑制BRD7基因启动子活性. 展开更多
关键词 BRD7基因 E2F6转录因子 启动子活性 荧光素酶检测技术 绿色荧光蛋白
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Sprouty1载体的构建及对NF-κB转录活性的调控影响
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作者 刘巍 李慧 廖世奇 《兰州大学学报(医学版)》 CAS 2010年第4期31-33,38,共4页
目的构建pCMV-MYC-SPRY1表达载体,应用荧光素酶报告基因实验研究pCMV-MYC-SPRY1对NF-κB信号转导通路的影响,以及对HEK293细胞增殖调控的研究。方法采用PCR技术在肝文库里扩增SPRY1编码的目的基因片段,将其构建到真核表达pCMV-MYC载体上... 目的构建pCMV-MYC-SPRY1表达载体,应用荧光素酶报告基因实验研究pCMV-MYC-SPRY1对NF-κB信号转导通路的影响,以及对HEK293细胞增殖调控的研究。方法采用PCR技术在肝文库里扩增SPRY1编码的目的基因片段,将其构建到真核表达pCMV-MYC载体上,用荧光素酶报告基因实验验证其对下游报告基因NF-κB转录活性的影响以及用GENMEDMTS细胞增殖检测试剂盒检测pCMV-MYC-SPRY1对HEK293细胞增殖的影响。结果成功构建pCMV-MYC-SPRY1表达载体,表明SPRY1负调控NF-κB的活性,对HEK293细胞增殖具有抑制作用。结论 pCMV-MYC-SPRY1表达载体的成功构建及对NF-κB转导通路的研究,为进一步研究SPRY1基因编码的蛋白质的功能打下了基础。 展开更多
关键词 MYC-SPRY1 PCR技术 荧光素酶报告基因 HEK293 增殖
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