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二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立
1
作者
谢志勤
谢芝勋
+14 位作者
张艳芳
李小凤
范晴
谢丽基
万丽军
罗思思
李孟
张民秀
曾婷婷
黄娇玲
王盛
李丹
韦悠
任红玉
阮志华
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第10期1232-1241,共10页
为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针...
为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,ARV阳性检出率为13.0%(12/92),MS阳性检出率为9.8%(9/92),混合感染阳性率为2.2%(2/92)。结果表明,本研究建立的二重ddPCR方法在定量检测ARV及MS时特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ARV及MS提供了更敏感的检测技术手段。
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关键词
二重微滴式数字PCR
定量检测
禽呼肠孤病毒
鸡滑液囊支原体
原文传递
鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达
被引量：
5
2
作者
杨俊兴
花群义
+5 位作者
陈焕春
陈兵
吕建强
曹琛福
阮周曦
张彩红
《动物医学进展》
CSCD
北大核心
2009年第8期5-8,共4页
根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体...
根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。
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关键词
鹿流行性出血病病毒(EHDV)
VP7基因
基因克隆
表达
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职称材料
题名
二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立
1
作者
谢志勤
谢芝勋
张艳芳
李小凤
范晴
谢丽基
万丽军
罗思思
李孟
张民秀
曾婷婷
黄娇玲
王盛
李丹
韦悠
任红玉
阮志华
机构
广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室农业农村部中国-东盟(广西)跨境动物疫病防控重点实验室
出处
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第10期1232-1241,共10页
基金
国家自然科学基金项目(31660715)
广西重点研发专项项目(桂科AB16380003)
+3 种基金
中央引导地方发展专项项目(桂科ZY19183013)
广西创新驱动专项项目(AA17204057)
广西“八桂学者”专项项目(2019A50)
国家“万人计划”领军人才专项项目(W02060083)。
文摘
为绝对定量检测禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,ARV阳性检出率为13.0%(12/92),MS阳性检出率为9.8%(9/92),混合感染阳性率为2.2%(2/92)。结果表明,本研究建立的二重ddPCR方法在定量检测ARV及MS时特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ARV及MS提供了更敏感的检测技术手段。
关键词
二重微滴式数字PCR
定量检测
禽呼肠孤病毒
鸡滑液囊支原体
Keywords
duplex droplet digital PCR(ddPCR)
quantitative detection
avian reovirus(ARV)
Myco-plasma synoviae(MS)
分类号
S859.659.4 [农业科学—临床兽医学]
原文传递
题名
鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达
被引量：
5
2
作者
杨俊兴
花群义
陈焕春
陈兵
吕建强
曹琛福
阮周曦
张彩红
机构
深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
华中农业大学动物医学院
出处
《动物医学进展》
CSCD
北大核心
2009年第8期5-8,共4页
基金
国家863计划项目(2006AA10Z445)
中国博士后科学基金项目(20080430855)
文摘
根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。
关键词
鹿流行性出血病病毒(EHDV)
VP7基因
基因克隆
表达
Keywords
Epizootic hemorrhagic disease virus of deer
VP7 protein
gene cloning
expression
分类号
S859.659.4 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立
谢志勤
谢芝勋
张艳芳
李小凤
范晴
谢丽基
万丽军
罗思思
李孟
张民秀
曾婷婷
黄娇玲
王盛
李丹
韦悠
任红玉
阮志华
《中国兽医科学》
CAS
CSCD
北大核心
2023
0
原文传递
2
鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达
杨俊兴
花群义
陈焕春
陈兵
吕建强
曹琛福
阮周曦
张彩红
《动物医学进展》
CSCD
北大核心
2009
5
下载PDF
职称材料
已选择
0
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