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非洲猪瘟病毒解旋酶D1133L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位 被引量：10
1
作者 侯景 申超超 +10 位作者 张大俊 杨博 史喜绢 张婷 崔卉梅 袁兴国 赵登率 陈学辉 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期1953-1962,共10页
旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL... 旨在通过预测分析和亚细胞定位研究非洲猪瘟病毒(ASFV)D1133L基因结构、亚细胞定位与功能间的关系。作者使用Mega6.0软件绘制了7株不同基因型的D1133L解旋酶和ASFV编码的其他5个解旋酶基因的系统进化树,使用EXPASY、PRABI和SWISS-MODEL软件预测了该基因所编码蛋白序列的二、三级结构;根据GenBank公布的ASFV序列(LR743116.1),合成D1133L基因并构建其重组真核表达质粒pCMV-D1133L,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,应用间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)研究了该蛋白的亚细胞定位。结果表明,通过ASFV解旋酶的基因系统进化树,发现5种解旋酶基因均相对保守。D1133L基因全长3402 bp,表达的蛋白为124.63 ku,G+C含量为6.1%,A+T含量为10.6%;二级结构分析表明α螺旋占48.90%,扩展链占13.50%,无规卷曲为33.27%;三级结构分析表明六自由度结构(six degree of freedom,QMQE)为0.20,覆盖率84%,且预测以α螺旋为主的高级结构;通过LOCSVMPSI分析预测,显示D1133L蛋白定位于细胞核内与细胞质内的概率是相同的。WB结果显示pCMV-D1133L质粒正常表达,IFA试验证明ASFV编码的解旋酶D1133L同时分布于细胞核和细胞质。本研究通过对D1133L基因序列、结构功能预测,并通过IFA验证了D1133L亚细胞分布,为进一步揭示D1133L基因功能奠定了一定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 解旋酶 D1133L基因 序列分析 结构预测 亚细胞定位
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塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡 被引量：10
2
作者 王咏 毛箬青 +2 位作者 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期811-820,共10页
塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过A... 塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过Annexin V-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,Annexin V-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Western blotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。 展开更多
关键词 塞内卡病毒A PK-15细胞 细胞凋亡 流式细胞术
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非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位 被引量：8
3
作者 申超超 李国丽 +7 位作者 张大俊 徐国伟 侯景 李丹 党文 张克山 郑海学 刘湘涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期1371-1381,共11页
前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表... 前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构;根据GenBank公布的Georgia 2007/1(FR682468.1)序列,合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒,Western blot验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明,以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照,其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守,在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致,保守序列为3′末端378 bp片段,高级结构以α螺旋为主,核定位序列预测其定位于细胞核内;构建真核表达质粒,成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 MGF 360-9L基因 序列分析 结构预测 亚细胞定位
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外来口蹄疫流行毒株跟踪分析与防控 被引量：8
4
作者 何继军 靳野 +9 位作者 马维民 杨亚民 吕律 郑海学 杨帆 曹伟军 郭建宏 李彦敏 刘在新 刘湘涛 《中国动物检疫》 CAS 2018年第11期52-55,61,共5页
2008年以来,外来口蹄疫流行毒株不断侵入,给我国造成巨大危害。分子流行病学研究表明,我国现有的主要流行毒株,如A/Sea-97、O/Mya-98、O/PanAsia和O/Ind-2001等,均系外来毒株。结合全球口蹄疫流行形势和毒株遗传衍化关系推测,这些毒株... 2008年以来,外来口蹄疫流行毒株不断侵入,给我国造成巨大危害。分子流行病学研究表明,我国现有的主要流行毒株,如A/Sea-97、O/Mya-98、O/PanAsia和O/Ind-2001等,均系外来毒株。结合全球口蹄疫流行形势和毒株遗传衍化关系推测,这些毒株由东南亚地区传入我国的可能性最大。此外,常年流行于中亚、西亚等国家的O/PanAsia-2、A/Iran-05和Asia1/Sindh-08等毒株,以及在印度等南亚地区流行的A/G VII和Asia1/G VIII等毒株传入我国的风险依旧存在。为及时判定外来口蹄疫威胁,做好诊断、免疫等阻断技术储备,本文就外来口蹄疫毒株流行情况和国家口蹄疫参考实验室有关技术储备工作进行总结,以期为我国外来口蹄疫防控提供参考。 展开更多
关键词 外来口蹄疫 分子流行病学 防控
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非洲猪瘟病毒D1133L蛋白增加宿主波形蛋白磷酸化而促进病毒在猪巨噬细胞中的复制 被引量：1
5
作者 陈玲玲 张婷 +11 位作者 郝雨 杨金柯 史喜绢 张大俊 杨行 赵登率 闫文倩 别鑫恬 陈国辉 郑海学 乐涛 张克山 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期720-732,共13页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133L蛋白 波形蛋白 蛋白互作 磷酸化
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宿主蛋白BST-2抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究 被引量：1
6
作者 赵美玉 杨行 +11 位作者 史喜绢 张大俊 赵登率 陈玲玲 别鑫恬 闫文倩 陈国辉 赵思越 李平 郑海学 栗孟飞 张克山 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期143-150,共8页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高致死率传染病。骨髓基质细胞抗原2(BST-2,也称为Tetherin/HM1.24/CD317)被鉴定为一种抑制包膜病毒释放的新型宿主限制因子,它可以将病... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高致死率传染病。骨髓基质细胞抗原2(BST-2,也称为Tetherin/HM1.24/CD317)被鉴定为一种抑制包膜病毒释放的新型宿主限制因子,它可以将病毒颗粒结合到细胞表面,随后在溶酶体中进行内化和降解,从而抑制病毒复制。因此,它对宿主的抗病毒作用十分重要。本实验室前期研究表明,怀孕猪血清会促进ASFV的复制。ITRAQ分析表明,BST-2蛋白属于下调前十的蛋白之一。为探究宿主蛋白BST-2与ASFV复制之间的关系,本试验通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对BST-2表达的影响;构建并合成了BST-2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot去探究外源过表达BST-2及敲低BST-2对ASFV体外复制的调控作用。结果显示,外源过表达BST-2显著抑制了ASFV的复制,敲低BST-2促进了ASFV的复制。本研究通过对BST-2进行过表达和敲低,证实了BST-2作为一种宿主抗病毒分子能抑制ASFV的体外复制,为进一步深入研究宿主蛋白抗ASFV功能提供了新的途径,也为ASF的防控提供了新思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 BST-2 天然免疫 宿主蛋白 抑制 体外复制
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呼吸道合胞病毒NS1蛋白鼠单克隆抗体的制备 被引量：1
7
作者 陈娇 王亚娟 +3 位作者 陈志华 茹毅 郑海学 裴晶晶 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1536-1547,共12页
本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建... 本研究旨在制备抗呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)单克隆抗体,以分析在转染和感染过程中NS1蛋白的表达和分布情况,并评估其在免疫沉淀反应中的应用价值。将NS1基因片段构建至原核表达质粒,经大肠杆菌表达、亲和层析纯化后得到NS1蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠后,通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术筛选能稳定分泌NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并将该单抗用于间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)与免疫印迹(Western blotting)检测,分析RSV NS1在过表达细胞和病毒感染细胞中的表达与分布情况,评估该单抗在免疫沉淀反应中的应用价值。结果发现,RSV NS1蛋白在大肠杆菌中成功表达及纯化,免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS1单抗,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1:15360000;使用该单抗鉴定出RSV NS1蛋白在转染和感染细胞中正常表达,IFA结果表明,NS1主要分布在细胞质与细胞核;并验证该单抗在免疫沉淀反应中作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS1蛋白。本研究经原核表达系统成功获得RSV NS1蛋白,成功制备出抗RSV NS1单抗,该抗体能特异性识别NS1蛋白,可被应用于免疫沉淀方法,为NS1蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 呼吸道合胞病毒 NS1蛋白 原核表达 单克隆抗体 免疫沉淀
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PRRSV阳性猪源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及特性分析
8
作者 常辉 王玉淼 +8 位作者 李静 李洋 荆扬 郑紫方 裴秀秀 陈劭 肖书奇 郑海学 齐萌 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1491-1501,共11页
本试验旨在研究临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后继发感染的细菌病原及其生物学特性,为实现PRRSV继发细菌感染的有效防控提供研究基础。无菌采集感染PRRSV死亡仔猪的胸腔... 本试验旨在研究临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后继发感染的细菌病原及其生物学特性,为实现PRRSV继发细菌感染的有效防控提供研究基础。无菌采集感染PRRSV死亡仔猪的胸腔积液进行细菌的分离与纯化,对分离菌进行形态学鉴定、分子生物学鉴定、药敏试验检测、耐药基因和毒力基因检测,进一步通过动物试验评估分离菌的致病性。结果发现,该菌为革兰阴性短杆菌,葡萄糖、尿素、蛋白胨水、枸橼酸盐、赖氨酸生化试验呈阳性,初步鉴定为克雷伯菌属细菌;细菌通用引物PCR扩增产物测序结果显示,该菌与巴基斯坦肉鸡源肺炎克雷伯菌的同源性为99.77%,进一步鉴定出分离菌株为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示,该株肺炎克雷伯菌对四环素、红霉素、阿奇霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素6种药物有较强的耐药性,对链霉素、卡那霉素不敏感;该菌携带3种耐药基因和6种毒力基因,对BALB/c小鼠具有较强的致病性,7.0×10^(8)CFU/m L攻毒时死亡率为100%。本研究自PRRSV感染死亡仔猪体内分离出1株肺炎克雷伯菌,该菌具有多重耐药性和较强的致病性;肺炎克雷伯菌是PRRSV感染的重要继发致病菌,对PRRSV阳性猪继发细菌感染的防治具有重要指导意义。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 肺炎克雷伯菌 毒力 耐药性 致病性
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宿主OAS2蛋白抑制非洲猪瘟病毒体外复制的研究
9
作者 赵思越 史喜绢 +11 位作者 杨行 张大俊 赵登率 陈国辉 陈玲玲 闫文倩 别鑫恬 赵美玉 李平 郑海学 张克山 郜原 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期577-583,共7页
为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰... 为了探究宿主蛋白2′,5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2)与非洲猪瘟病毒(ASFV)复制之间的关系,本研究通过蛋白免疫印迹(Western-blot)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了ASFV感染对宿主OAS2的调控作用;构建并合成OAS2真核表达质粒以及siRNA干扰序列,通过RT-qPCR、Western-blot方法探究在MA-104细胞中外源过表达OAS2及在PAMs细胞中下调OAS2表达对ASFV体外复制的影响。结果显示,ASFV感染PAMs细胞后,OAS2的蛋白水平和转录水平皆上调,并且外源过表达OAS2显著抑制了ASFV的复制,下调OAS2表达促进了ASFV的复制。本研究通过对宿主蛋白OAS2进行过表达和敲低,证实了OAS2可以抑制ASFV体外复制,该结果为进一步研究宿主对ASFV的抗病毒免疫研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 OAS2 天然免疫 抑制
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非洲猪瘟病毒毒力因子MGF360-4L靶向降解RIPK3促进病毒复制的研究
10
作者 曹雪静 范许许 +9 位作者 朱兆宇 裴丹诗 王一卓 张继燕 何路 李熙忠 任青峰 郑海学 万博 李伟伟 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期995-1001,I0001,共8页
本研究首先利用CellTiter-Glo试剂盒测定MGF360-4L对细胞活力的影响;通过蛋白免疫印迹(Western-blot)检测MGF360-4L及其突变体对细胞坏死通路关键接头分子表达的影响;通过同源重组技术构建MGF360-4L缺失毒株(ASFV-ΔMGF360-4L);利用实... 本研究首先利用CellTiter-Glo试剂盒测定MGF360-4L对细胞活力的影响;通过蛋白免疫印迹(Western-blot)检测MGF360-4L及其突变体对细胞坏死通路关键接头分子表达的影响;通过同源重组技术构建MGF360-4L缺失毒株(ASFV-ΔMGF360-4L);利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析ASFV野生毒株(ASFV-WT)与其缺失毒株(ASFV-ΔMGF360-4L)复制水平的差异;通过Western-blot检测MGF360-4L缺失对ASFV诱导的细胞坏死的影响。结果表明,MGF360-4L包含1个RHIM,并通过溶酶体途径降解RIPK3,从而抑制细胞坏死通路的活化;MGF360-4L发挥上述功能依赖其RHIM结构域;ASFV-ΔMGF360-4L毒株复制水平低于野生毒株,且该缺失毒株能够诱导更高水平的细胞坏死。本研究证实ASFV毒力因子MGF360-4L依赖其RHIM结构域靶向降解RIPK3,并促进病毒自身复制,为ASFV致病机理的阐明提供了科学数据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 细胞坏死 RHIM RIPK3 MGF360-4L
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猪伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
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作者 马国祥 曹丽艳 +12 位作者 张娟 张宇 万颖 孔祥雨 李想通 王娅婷 段月月 袁聪 施磊 郭庆勇 翟少华 郑海学 王琦 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1065-1071,共7页
为了制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白单克隆抗体,本研究利用原核表达系统表达gB蛋白的主要抗原区(540~734 aa),获得重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用杂交瘤技术,经过细胞筛选和亚克隆,获得1株能稳定分泌抗gB蛋白的单克隆抗体,将其命名为1C1... 为了制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gB蛋白单克隆抗体,本研究利用原核表达系统表达gB蛋白的主要抗原区(540~734 aa),获得重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用杂交瘤技术,经过细胞筛选和亚克隆,获得1株能稳定分泌抗gB蛋白的单克隆抗体,将其命名为1C10。经间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blot)验证,1C10具有良好的特异性,能识别PRV感染细胞时表达的gB蛋白。亚类鉴定结果表明,1C10重链为IgG2a型,轻链为kappa型。ELISA结果表明,纯化后的腹水效价高于1∶128000。综上,本研究成功表达了PRV gB蛋白,并制备了抗PRV gB蛋白单克隆抗体,为进一步探究PRV gB蛋白的结构和功能以及后期建立PRV诊断方法及致病机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 gB蛋白 原核表达 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制
12
作者 闫文倩 侯景 +12 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 史喜绢 张大俊 别鑫恬 陈国辉 陈玲玲 何路 赵美玉 赵思越 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期854-859,共6页
旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白 单克隆抗体
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KLHL家族蛋白的研究进展
13
作者 陈创伟 张伟 +7 位作者 吕岳芹 黄梦瑶 孙琬珈 周嘉慧 李敏 曹伟军 郑海学 杨帆 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1385-1390,共6页
本文从Kelch-like(KLHL)家族蛋白的结构特点出发,围绕其在天然免疫、肿瘤等疾病方面的作用展开叙述,旨在为KLHL家族蛋白功能的研究和肿瘤等疾病的预防和治疗提供思路。
关键词 KLHL 结构与功能 天然免疫 疾病 肿瘤
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呼吸道合胞病毒NS2蛋白单克隆抗体的制备及初步研究
14
作者 王亚娟 陈娇 +3 位作者 陈志华 茹毅 郑海学 裴晶晶 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期302-313,共12页
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,... 呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一种引起婴幼儿下呼吸道感染的RNA病毒,其非结构蛋白(Nonstructural protein 2,NS2)在病毒复制和宿主抗病毒免疫中起到关键作用,但目前尚无商品化NS2单克隆抗体。本研究选取NS2基因,经密码子优化后构建重组质粒pET-32a-NS2。将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经16℃诱导表达后,对表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定。应用亲和层析技术纯化重组蛋白,将纯化的蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并将该单克隆抗体用于Western blot分析、免疫荧光检测和免疫沉淀反应。结果表明,诱导后的重组蛋白为可溶性表达,并经纯化后得到高纯度的NS2蛋白;纯化的NS2蛋白免疫小鼠后,获得了一株特异性强、反应性好的RSV NS2单克隆抗体4A4 2B2,其亚型为IgG1,且抗体效价可达1∶1024000;使用该单克隆抗体鉴定出RSV NS2蛋白在转染和感染细胞中正常表达,且NS2主要分布在细胞质中,在细胞核周围形成点状聚集体;在免疫沉淀反应中,该单克隆抗体作为捕获抗体能够特异性结合细胞中表达的NS2蛋白,为NS2蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 呼吸道合胞病毒 NS2蛋白 原核表达 单克隆抗体
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南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白单抗的制备与特性研究
15
作者 朱昱茜 石正旺 +8 位作者 罗俊聪 陈婕 林永玉 席韬 张帆 石鑫泰 郑海学 包世俊 田宏 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期794-801,共8页
为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓... 为制备南非2型口蹄疫病毒型特异性单克隆抗体,本研究通过原核系统表达南非2型口蹄疫病毒VP1蛋白,亲和层析的方法纯化目的蛋白。将纯化的VP1蛋白使用弗氏佐剂乳化后,免疫BALB/c小鼠,待加强免疫后取血清效价最稳定的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,应用间接ELISA筛选针对南非2型VP1蛋白的单克隆抗体。采用特异性试验、叠加试验和抗体亚型鉴定等方法对筛选的单克隆抗体特性进行分析。结果发现,本研究成功表达南非2型VP1蛋白,筛选出2株能稳定分泌特异性针对南非2型VP1蛋白的杂交瘤细胞株(3B2和6F2),其亚型分别为IgG2a和IgG1,叠加试验结果表明2株单抗的叠加系数>40%,说明两株单抗针对不同的抗原位点;单抗的效价可达1∶256000,特异性试验证明2株单抗均不与O型、A型口蹄疫病毒及其他常见猪病病毒产生交叉反应。由此可见,本研究制备的单克隆抗体具有良好的特异性和反应性,为南非2型口蹄疫病毒定型诊断和未来疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 南非2型 口蹄疫病毒 VP1蛋白 特异性单克隆抗体
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基于酶促重组酶扩增的非洲猪瘟病毒检测方法
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作者 冯露 田宏 +7 位作者 郑海学 石正旺 罗俊聪 张晓阳 尉娟娟 周静 廖焕程 王婉莹 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4226-4231,共6页
建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件... 建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 ERA 核酸检测 等温扩增
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仔猪口蹄疫母源抗体衰减规律研究 被引量：4
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作者 卢炳州 刘华南 +6 位作者 赵俊皓 王国庆 郑海学 刘湘涛 郭建宏 何继军 张克山 《畜牧与兽医》 北大核心 2019年第6期100-103,共4页
为了明确仔猪体内A型口蹄疫母源抗体衰减规律,为仔猪口蹄疫疫苗首免时间的确定提供理论依据,选取预产期相同、口蹄疫抗体水平(A型)有差异的5头母猪,每头母猪随机选取5头仔猪并分16个时间点采集外周血,利用液相阻断ELISA对仔猪体内A型口... 为了明确仔猪体内A型口蹄疫母源抗体衰减规律,为仔猪口蹄疫疫苗首免时间的确定提供理论依据,选取预产期相同、口蹄疫抗体水平(A型)有差异的5头母猪,每头母猪随机选取5头仔猪并分16个时间点采集外周血,利用液相阻断ELISA对仔猪体内A型口蹄疫抗体进行检测,评估其消减规律。结果显示:脐带血不传播母源抗体,仔猪获得母源抗体保护的唯一途径是吃母乳;仔猪采食初乳后体内A型口蹄疫母源抗体可在吃初乳后当天达到峰值,而后随时间增加而降低;当母猪分娩时抗体水平为1∶1024时,仔猪63日龄左右体内抗体水平降低至1∶45;当母猪分娩时抗体水平为1∶720时,仔猪56日龄左右体内抗体水平降低至1∶45;当母猪分娩时抗体水平为1∶360时,仔猪28日龄左右体内抗体水平降低至1∶45。仔猪体内A型口蹄疫抗体衰减时间和分娩时母猪抗体水平呈正相关性。本文研究结果为制定科学合理的仔猪口蹄疫疫苗免疫程序提供数据支撑。 展开更多
关键词 口蹄疫 母源抗体 仔猪 衰减规律
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过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用 被引量：4
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作者 张婷 杨博 +13 位作者 崔卉梅 袁兴国 赵登率 杨金柯 郝雨 陈学辉 闫文倩 申超超 史喜绢 张大俊 杨行 刘湘涛 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1877-1885,共9页
旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分... 旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明:ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133L基因 MA-104细胞 基因功能 过表达细胞系
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STING agonist 22免疫增强剂配伍ASFV P30蛋白对猪免疫效果的评价
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作者 彭勤 曹伟军 +5 位作者 杨帆 刘华南 茹毅 朱紫祥 郑海学 张桂红 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1137-1148,共12页
本试验旨在探究STING agonist 22为候选免疫增强剂,配伍ASFV P30靶标蛋白开展对猪的免疫效果评价,为非洲猪瘟亚单位疫苗免疫增强剂的筛选提供前期实验依据。选取本实验室原核表达ASFV免疫原性较高的P30结构蛋白作为靶标抗原,并结合STING... 本试验旨在探究STING agonist 22为候选免疫增强剂,配伍ASFV P30靶标蛋白开展对猪的免疫效果评价,为非洲猪瘟亚单位疫苗免疫增强剂的筛选提供前期实验依据。选取本实验室原核表达ASFV免疫原性较高的P30结构蛋白作为靶标抗原,并结合STINGagonist 22免疫增强剂与ISA201VG佐剂配伍ASFV P30蛋白2次免疫试验猪,比较STING agonist 22免疫增强剂诱导细胞免疫、体液免疫和抗原递呈反应的增强作用。结果显示,与单独201VG佐剂配伍相比,增加STING agonist 22免疫增强剂组免疫试验猪可以显著提早P30介导的抗体应答时间,提高B细胞成熟分化相关转录因子的表达水平,促进DCs成熟并增强其抗原递呈。本研究结果表明,STING agonist 22免疫增强剂配伍ASFV P30蛋白可以明显提高猪的细胞免疫、体液免疫反应及诱导更强的抗原递呈,可作为一种ASF亚单位疫苗的免疫增强剂。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 STING agonist 22 免疫增强剂 树突状细胞
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猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA检测方法的建立和初步应用
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作者 王婉莹 石正旺 +5 位作者 罗俊聪 廖焕程 冯露 郑海学 田宏 蔺国珍 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1302-1308,共7页
为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)Ig A抗体,以PEDV重组S蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体,建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显... 为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)Ig A抗体,以PEDV重组S蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的小鼠抗猪Ig A单克隆抗体为检测抗体,建立并优化了PEDV Ig A抗体的ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及临床样品检测性能。结果显示:该方法抗原最佳包被质量浓度为2μg/m L,酶标抗体的最佳工作浓度为1:25000,血清最佳稀释度为1:50;与猪伪狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、塞内卡病毒、口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应;灵敏度为1:800;批内、批间变异系数均小于10%;与IDEXX商品化试剂盒的检测结果具有高度一致性。结果证明,本研究中建立的PEDV Ig A抗体检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,适用于猪流行性腹泻的临床诊断与防控、流行病学调查以及免疫效果评估。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 IGA抗体 ELISA
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