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鼠源pEGFP-C1-TMEM88真核表达质粒的构建及其功能研究 被引量：1
1
作者 李良云 潘林鑫 +4 位作者 杨俊发 胡爽 张濛 李俊 徐涛 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第12期1865-1870,共6页
目的构建鼠源真核表达载体pEGFP-Cl-跨膜蛋白88质粒(pEGFP-Cl-TMEM88),并观察其对RAW264.7细胞中炎症因子分泌的影响和对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法在小鼠正常肝细胞株(AML-12)中提取RNA并且逆转录为cDNA,同时将引物稀释到10 p... 目的构建鼠源真核表达载体pEGFP-Cl-跨膜蛋白88质粒(pEGFP-Cl-TMEM88),并观察其对RAW264.7细胞中炎症因子分泌的影响和对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法在小鼠正常肝细胞株(AML-12)中提取RNA并且逆转录为cDNA,同时将引物稀释到10 pmol/F,其余作为储备液。采用PCR技术扩增跨膜蛋白88(TMEM88)并鉴定,使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收。再对PCR产物及载体进行酶切回收,酶切片段连接后,进行连接产物的转化、挑菌、摇菌、质粒抽提。酶切鉴定后,送至测序鉴定。将构建好的质粒转染至小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7细胞中,通过MTT实验和流式细胞术检测其对细胞增殖和凋亡的影响,并用ELISA技术检测炎症因子:白细胞介素6(IIC)、肿瘤坏死因子c(TNF-t)在RAW264.7细胞中的表达。结果测序结果显示pEGFP-Cl-TMEM88真核表达质粒构建成功;MTT实验结果显示:48 h后过表达TMEM88组细胞的增殖率为(0.71±0.04),显著低于对照组(0.94±0.06)(F=21.55,P<0.01);流式细胞术结果显示:过表达TMEM88组细胞的凋亡率为(11.52±1.43)%,显著高于对照组(7.78±1.67)%(F=10.07,P<0.05);ELISA检测结果显示:转染pEGFP-Cl-TMEM88质粒后的RAW264.7细胞中的HT'TNF-/表达较对照组升高&结论TMEM88能够显著抑制RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡,TMEM88在RAW264.7细胞中炎症因子HIL-6、TNF-a的表达升高,为进一步了解TMEM88的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 pEGFP-F1-TMEM88 RAW264.7细胞 增殖 凋亡 白细胞介素谷 肿瘤坏死因子谷
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