基于非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的间接ELISA检测方法的建立与应用 被引量：9

1

作者 王兆贵 赵亚茹 +10 位作者 杨吉飞 牛庆丽 刘银光 敬梦瑶 杨赛霞 吕欣倩 刘猛 姚永海 关贵全 刘志杰 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期403-411,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种危害性极强的病毒性疾病,该病的发生和流行对全球养猪业、猪肉食品供应及经济发展造成了巨大影响。ASFV基因组较大、编码蛋白众多,但目前很多病毒蛋白的功能尚不清楚。由于缺乏有效的治疗措施和安全的疫苗,所以ASF的防控及疫区的净化仍然面临巨大挑战,而早期、快速、可靠的实验室诊断仍然是该病防控的重要手段。本研究以ASFV基因Ⅱ型毒株的基因组为模板,扩增A104R、B602L、CP204L (P30)、B646L(P72)和K205R基因,并将其克隆至表达载体pET-30a,构建原核表达质粒,经IPTG诱导后表达5种病毒蛋白,其中p A104R、pK205R为可溶性表达,P30、P72、pB602L为包涵体表达。经Western-blot分析鉴定蛋白的抗原性,五种原核表达的蛋白都能够和ASF阳性血清发生特异性反应,通过比较,筛选出pA104R作为最佳诊断抗原,并初步建立了ASFV抗体检测间接ELISA方法。该方法能够敏感、特异的检测ASFV阳性血清,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清均无交叉反应。利用建立的间接ELISA方法与商品化间接ELISA抗体检测试剂盒平行检测田间样本,结果表明,本研究建立的方法与商品化试剂盒之间的符合率达到94.7%(142/150)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法能够用于ASF血清抗体的检测。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 蛋白纯化 间接ELISA

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非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：9

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作者 赵亚茹 韩蓉 +7 位作者 杨吉飞 牛庆丽 关贵全 罗建勋 刘光远 殷宏 GRZEGORZ Wozniakowski 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期805-811,共7页

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入pET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达pET-28a-K205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单... 将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入pET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达pET-28a-K205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为IgG1型;单抗的腹水效价分别为1∶51200、1∶409600和1∶102400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟 非洲猪瘟病毒 K205R蛋白 单克隆抗体

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基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立 被引量：9

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作者 孙燕燕 赵亚茹 +9 位作者 李昕 杨吉飞 牛庆丽 林密 王兆贵 刘猛 关贵全 殷宏 蒋韬 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期939-945,共7页

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控... 为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p30蛋白 抗体检测 金纳米颗粒 免疫层析法

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非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：4

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作者 敬梦瑶 牛庆丽 +8 位作者 杨吉飞 吕欣倩 樊洁 赵亚茹 杨赛霞 张忠辉 关贵全 殷宏 刘志杰 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期177-183,共7页

为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体p ET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆... 为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体p ET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性,用重组蛋白免疫新西兰大白兔制备家兔抗pO174L蛋白的多克隆抗体;利用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价,并通过Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,用PCR扩增的O174L基因片段长564 bp,与预期相符;双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET-28a-O174L构建成功,在原核表达系统成功地表达并获得了可溶性蛋白pO174L,分子质量约为21.5 ku;用纯化的蛋白免疫动物后制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶512000;Western-blot和IFA结果显示制备的抗体能够特异性地识别ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞中表达的天然蛋白pO174L。本研究为深入解析pO174L蛋白的功能及其在ASFV感染和致病过程中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 pO174L蛋白 原核表达 多克隆抗体

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浮动式核电站温排水热扩散模拟研究 被引量：3

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作者 田力荣 方园 +3 位作者 杨继飞 孙海军 高山 乔磊 《汽轮机技术》 北大核心 2019年第4期271-274,共4页

采用标准k-ε湍流模型对浮动式核电站在3种洋流速度(0m/s、0.06m/s、0.2m/s)和两种循环冷却水取、排水口布置方式下(底进侧排、底进底排),温排水对循环冷却水取水口以及周围海域温度的影响进行三维数值模拟研究。研究结果表明:在底进侧... 采用标准k-ε湍流模型对浮动式核电站在3种洋流速度(0m/s、0.06m/s、0.2m/s)和两种循环冷却水取、排水口布置方式下(底进侧排、底进底排),温排水对循环冷却水取水口以及周围海域温度的影响进行三维数值模拟研究。研究结果表明:在底进侧排的布置方式下,温排水热扩散对取水口温升不造成影响,对作业海域造成的海水温度升高范围也在国家标准规定的范围之内;洋流速度的存在,使温排水沿洋流方向扩散增强,且洋流速度越大,扩散范围越广。有洋流条件下,底进底排的布置方式会造成取水口附近海水温度升高,且洋流速度越大,温升越大。研究结果对浮动式核电站系统设计以及主汽轮机组相关设计参数提供设计依据。 展开更多

关键词 浮动式核电站 温排水 洋流速度 数值模拟

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基于多目标的汽车前端框架拓扑优化 被引量：2

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作者 杨剑飞 周超群 +1 位作者 王建彬 李飞 《井冈山大学学报（自然科学版）》 2021年第4期87-95,共9页

针对汽车前端框架的结构和工况特点,建立基于Hyperworks的有限元模型,运用带权重的折衷规划法定义综合目标函数来进行多目标拓扑优化,通过灰色关联法和层次分析法分别计算静态多工况下柔度的权重以及动态低阶频率的权重。结果表明:优化... 针对汽车前端框架的结构和工况特点,建立基于Hyperworks的有限元模型,运用带权重的折衷规划法定义综合目标函数来进行多目标拓扑优化,通过灰色关联法和层次分析法分别计算静态多工况下柔度的权重以及动态低阶频率的权重。结果表明:优化后的汽车前端框架最大变形、最大应力分别降低了21.67%、34.39%;第一阶模态提高了10.56%;质量从3.55kg降低到3.32kg减轻了7%。采用多目标拓扑优化后的汽车前端框架不仅有效提高刚度、强度和固有频率性能基础,还能促进汽车前端轻量化水平的提升。 展开更多

关键词 拓扑优化 多目标 汽车前端框架 权重 轻量化

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非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：1

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作者 吕欣倩 牛庆丽 +9 位作者 樊洁 杨吉飞 赵亚茹 张忠辉 杨赛霞 敬梦瑶 耿抒贤 关贵全 刘志杰 殷宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1392-1397,共6页

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后... 为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 NP419L基因 原核表达 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒解旋酶Q706L基因的生物信息学分析及原核表达

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作者 王国超 张忠辉 +9 位作者 白鸽 赵亚茹 吴奇强 王一望 孙华林 杨吉飞 关贵全 殷宏 罗建勋 牛庆丽 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1545-1551,共7页

为了解非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)解旋酶pQ706L的功能,通过生物信息学方法对GenBank中公布的不同基因型的ASFV解旋酶Q706L基因序列进行分析,运用在线软件ExPASy、GOR4、SWISS-MODEL对该蛋白的理化性质及结构进行了... 为了解非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)解旋酶pQ706L的功能,通过生物信息学方法对GenBank中公布的不同基因型的ASFV解旋酶Q706L基因序列进行分析,运用在线软件ExPASy、GOR4、SWISS-MODEL对该蛋白的理化性质及结构进行了预测分析,并进一步构建原核表达载体进行诱导表达及纯化鉴定。结果显示:Q706L基因长度为2 121 bp,在不同毒株和基因型间高度保守;经ExPASy预测,pQ706L蛋白的分子式为C6440H10761N2121O2643S502,属于疏水性蛋白,稳定性差;GOR4预测的二级结构显示,α螺旋是其主要结构形式,占比为42.07%;三级结构预测报告QMQE值为0.38,覆盖率为66%。以ASFV-CN/SC/2019毒株基因组为模板,成功构建了原核表达质粒pET-30a-Q706L,进行诱导表达及SDS-PAGE分析,得到78.3 ku的蛋白。纯化后经Western-blot鉴定,获得了纯度较高的目的蛋白,该蛋白且能够与ASFV阳性血清发生特异性反应。上述研究结果为进一步解析该蛋白的功能奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 Q706L基因 生物信息学 原核表达

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波纹管J-T制冷器的可靠性改进研究

9

作者 刘志勇 杨继飞 《红外》 CAS 2021年第3期25-30,共6页

作为红外探测器组件的重要组成部分,波纹管J--T制冷器得到了广泛应用。在振动环境下长期使用时,作为自主调节元件的波纹管会出现流量异常、无法实现自调等故障。为了提高制冷器在长期振动环境中的可靠性,更改了制冷器结构,并创新性地使... 作为红外探测器组件的重要组成部分,波纹管J--T制冷器得到了广泛应用。在振动环境下长期使用时,作为自主调节元件的波纹管会出现流量异常、无法实现自调等故障。为了提高制冷器在长期振动环境中的可靠性,更改了制冷器结构,并创新性地使用了加装膜片弹簧与聚四氟乙烯导环的两点支撑结构。该结构对制冷器的弹性运动部件具有可靠的径向支撑,明显提高了制冷器的抗振性能,并在实践中取得了很好的效果。此外,本文中的设计研究也为将来提高波纹管J--T制冷器的抗振性能提供了思路。 展开更多

关键词 自调J--T制冷器 波纹管 振动

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伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达与鉴定

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作者 于培发 刘志杰 +7 位作者 牛庆丽 杨吉飞 王振国 翟斌涛 潘玉平 关贵全 罗建勋 殷宏 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第1期214-220,共7页

为获得伽氏疏螺旋体尚志株(B.garinii SZ)的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),经PCR、双酶切及测序验证正确后... 为获得伽氏疏螺旋体尚志株(B.garinii SZ)的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3),经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和纯化,然后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70ku的表达产物;Western blotting分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应,获得的多克隆抗体也可识别天然蛋白。本试验成功表达了B.garinii SZ株P66蛋白,并制备了多克隆抗体,为后续B.garinii SZ株P66蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 伽氏疏螺旋体尚志株 P66 原核表达 多克隆抗体

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IgG4阴性的自身免疫性胰腺炎2例报告并文献复习

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作者 杨见林 季慧范 +1 位作者 韩飞 郭晓林 《临床肝胆病杂志》 CAS 2017年第9期1784-1786,共3页

自身免疫性胰腺炎（autoimmune pancreatitis,AIP）是一种炎症组织中伴IgG4阳性淋巴细胞和浆细胞浸润,血清IgG4水平升高的自身免疫相关特殊类型慢性胰腺炎,AIP发病率较低,约占慢性胰腺炎的4%~6%,发病率约为0.82/10万[1],

关键词 免疫球蛋白G 胰腺炎 病例报告

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