【目的】视网膜色素上皮(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发病机制中起着核心作用。本研究旨在探讨内质网应激及其重要的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化损伤中起到的作用,从而为阐明ARMD的发病机制提供...【目的】视网膜色素上皮(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发病机制中起着核心作用。本研究旨在探讨内质网应激及其重要的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化损伤中起到的作用,从而为阐明ARMD的发病机制提供思路。【方法】用75μmol/L丙烯醛分别处理人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)2~24 h,观察内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及XBP1的表达。用XBP1 si RNA转染细胞,下调XBP1蛋白水平,用Western blot检测抗氧化基因Nrf2、SOD2在蛋白水平的表达;用DCF染色观察细胞活性氧产物(ROS)的产生;用TUNEL染色观察细胞凋亡改变。细胞用XBP1 si RNA或对照si RNA预处理后,加入丙烯醛,检测RPE细胞的凋亡情况。7只XBP1^(flox/flox)小鼠,一眼视网膜下注射Cre腺病毒,对侧眼视网膜下注射GFP腺病毒作对照。1周后取眼球。其中3只小鼠用TRIzol提取RPE的RNA,用实时RT-PCR法,检测XBP1的下游基因ERdj4和p58IPK在RNA水平的表达。另4只小鼠眼球作视网膜冰冻切片,观察腺病毒在视网膜下腔的表达,用免疫荧光染色法检测XBP1以及抗氧化基因Nrf2和SOD2在RPE的表达。【结果】丙烯醛分别处理RPE细胞2 h和4 h,GRP78的表达明显增加。处理6 h XBP1蛋白激活。XBP1表达的下调伴有抗氧化基因Nrf2和SOD2表达的减少,细胞内ROS的增加,并诱发细胞的凋亡。敲低XBP1以后丙烯醛对细胞的毒性作用明显增加。通过视网膜下注射Cre腺病毒成功转染XBP1^(flox/flox)小鼠RPE。与对照组相比,转染Cre腺病毒的小鼠RPE内的XBP1蛋白表达明显减少,RPE内的ERdj4和p58IPK RNA水平显著下调;抗氧化基因Nrf2和SOD2表达明显减少。【结论】丙烯醛作用于RPE细胞,激活内质网应激以及转录因子XBP1。抑制XBP1引起RPE内抗氧化基因表达的减少,ROS的产生增加,并且增加丙烯醛的细胞毒性。XBP1参与RPE细胞内抗氧化应激防御机制。展开更多
文摘【目的】视网膜色素上皮(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发病机制中起着核心作用。本研究旨在探讨内质网应激及其重要的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化损伤中起到的作用,从而为阐明ARMD的发病机制提供思路。【方法】用75μmol/L丙烯醛分别处理人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)2~24 h,观察内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及XBP1的表达。用XBP1 si RNA转染细胞,下调XBP1蛋白水平,用Western blot检测抗氧化基因Nrf2、SOD2在蛋白水平的表达;用DCF染色观察细胞活性氧产物(ROS)的产生;用TUNEL染色观察细胞凋亡改变。细胞用XBP1 si RNA或对照si RNA预处理后,加入丙烯醛,检测RPE细胞的凋亡情况。7只XBP1^(flox/flox)小鼠,一眼视网膜下注射Cre腺病毒,对侧眼视网膜下注射GFP腺病毒作对照。1周后取眼球。其中3只小鼠用TRIzol提取RPE的RNA,用实时RT-PCR法,检测XBP1的下游基因ERdj4和p58IPK在RNA水平的表达。另4只小鼠眼球作视网膜冰冻切片,观察腺病毒在视网膜下腔的表达,用免疫荧光染色法检测XBP1以及抗氧化基因Nrf2和SOD2在RPE的表达。【结果】丙烯醛分别处理RPE细胞2 h和4 h,GRP78的表达明显增加。处理6 h XBP1蛋白激活。XBP1表达的下调伴有抗氧化基因Nrf2和SOD2表达的减少,细胞内ROS的增加,并诱发细胞的凋亡。敲低XBP1以后丙烯醛对细胞的毒性作用明显增加。通过视网膜下注射Cre腺病毒成功转染XBP1^(flox/flox)小鼠RPE。与对照组相比,转染Cre腺病毒的小鼠RPE内的XBP1蛋白表达明显减少,RPE内的ERdj4和p58IPK RNA水平显著下调;抗氧化基因Nrf2和SOD2表达明显减少。【结论】丙烯醛作用于RPE细胞,激活内质网应激以及转录因子XBP1。抑制XBP1引起RPE内抗氧化基因表达的减少,ROS的产生增加,并且增加丙烯醛的细胞毒性。XBP1参与RPE细胞内抗氧化应激防御机制。
