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PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：9
1
作者 黄海鑫 宋心玥 +7 位作者 汪伟 李笨 王茂鹏 肖朋朋 郑敏 金宁一 孙文超 鲁会军 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期141-146,共6页
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 猪肠道α冠状病毒 二重RT-PCR
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小反刍兽疫流行状况及分子诊断技术研究现状 被引量：7
2
作者 吴昊天 满初日嘎 +3 位作者 王凤阳 李昌 金宁一 陈巧玲 《动物医学进展》 北大核心 2022年第1期122-126,共5页
小反刍兽疫(PPR)是一种主要感染山羊和绵羊的传染病,病原为副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV)。PPRV基因组由6个基因组成,依据N和F基因可将PPRV分为4个谱系或者基因群,我国流行的PPRV属于谱系Ⅳ。2007年我国首次报道发生PPR疫... 小反刍兽疫(PPR)是一种主要感染山羊和绵羊的传染病,病原为副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(PPRV)。PPRV基因组由6个基因组成,依据N和F基因可将PPRV分为4个谱系或者基因群,我国流行的PPRV属于谱系Ⅳ。2007年我国首次报道发生PPR疫情,在2014年大流行后,农业农村部加强了PPR的防疫措施。目前,国内的PPR疫情基本得到了控制,主要风险来自于境外输入和野生动物。PPRV分子检测是防疫措施的重要一环,目前已经建立了多种针对PPRV不同基因的检测方法。将新型技术应用于PPRV分子检测,开发小型化、快速化、高通量的PPRV检测方法将是未来的发展方向。 展开更多
关键词 小反刍兽疫 小反刍兽疫病毒 分子流行病学 分子检测
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腺病毒诊断方法的研究进展 被引量：7
3
作者 冯冠榕 田丽平 +3 位作者 鲁会军 金宁一 李楠 肖朋朋 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2021年第2期241-244,F0004,共5页
腺病毒(adenovirus,AdV)可引发人兽共患的急性传染病。优化检测技术对该病毒早发现、早确诊、早治疗的防控具有重要意义。本文总结了近年来AdV的检测技术与方法,从病毒分离鉴定、形态学观察、核酸检测、抗原检测及特异性抗体检测等5个... 腺病毒(adenovirus,AdV)可引发人兽共患的急性传染病。优化检测技术对该病毒早发现、早确诊、早治疗的防控具有重要意义。本文总结了近年来AdV的检测技术与方法,从病毒分离鉴定、形态学观察、核酸检测、抗原检测及特异性抗体检测等5个方面分别介绍数种诊断方法,涉及科研、临床及养殖等多个领域,为该病毒的防控提供检测技术参考。 展开更多
关键词 腺病毒 实验室诊断 人兽共患病 综述
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尼帕病毒全球流行态势解析 被引量：5
4
作者 金宁一 许汪 +3 位作者 杜寿文 李昌 李体远 吴诗品 《新发传染病电子杂志》 2019年第3期133-136,共4页
尼帕病毒(Nipah Virus,NiV)是一种严重威胁人类与动物健康以及公共卫生安全的人兽共患病原体,可通过直接接触或气溶胶的形式进行传播,导致人或动物感染甚至死亡。本文总结了自1998年马来西亚发生第一例感染者至今,NiV暴发和流行过的国... 尼帕病毒(Nipah Virus,NiV)是一种严重威胁人类与动物健康以及公共卫生安全的人兽共患病原体,可通过直接接触或气溶胶的形式进行传播,导致人或动物感染甚至死亡。本文总结了自1998年马来西亚发生第一例感染者至今,NiV暴发和流行过的国家和地区,并分析了NiV的主要传播方式。调查研究发现,NiV在西太平洋地区和东南亚地区的流行呈上升趋势,且我国的广西、云南等南方地区属于NiV流行的高危区域,虽然目前没有相关病例报告,但应当加强预警与流行病学研究,时刻监测该病毒对我国的入侵。 展开更多
关键词 尼帕病毒 流行态势 人兽共患病
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猪圆环病毒2型(PCV2) Cap基因原核表达及抗血清制备 被引量：5
5
作者 姜宇航 宋利娜 +7 位作者 许汪 杜寿文 陈竞 付婷婷 郝鹏飞 李秋璇 金宁一 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期237-241,共5页
Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重... Cap蛋白作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重要结构蛋白,可以实现诱导机体免疫保护。以本实验室分离保存的PCV2毒株的Cap基因作为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并将该PCR产物连接至原核表达载体pET-28a上,获得重组质粒pET-28a-PCV2 Cap。将验证正确的菌种接入HB-pET自诱导培养基,过夜培养,SDS-PAGE及Western blot验证其表达,可获得28000左右的目的蛋白。利用亲和层析技术纯化PCV2 Cap蛋白,免疫BALB/c小鼠获得小鼠阳性血清,通过ELISA方法检测其效价,并用Western blot验证其活性。结果显示,本试验成功应用大肠杆菌表达了PCV2 Cap蛋白,表达的蛋白具有免疫原性,并获得小鼠阳性血清,为PCV2 Cap蛋白的功能研究、鉴定、抗体及疫苗研制和病原检测奠定理论基础。 展开更多
关键词 PCV2 Cap基因 原核表达 小鼠阳性血清
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VPS34蛋白抑制剂PIKⅢ体外广谱抗冠状病毒作用研究
6
作者 于啸洋 矫立敏 +5 位作者 葛晨晨 李嘉琪 尚超 薛书江 金宁一 李霄 《动物医学进展》 北大核心 2023年第8期1-5,共5页
为了寻找有效抗冠状病毒感染的治疗靶点,用CCK-8法和结晶紫法检测VPS34蛋白抑制剂PIKⅢ对细胞的敏感性,通过CCK-8法检测PIKⅢ抗病毒活性,通过病毒滴度及RT-PCR检测PIKⅢ对冠状病毒复制的影响。结果显示,PIKⅢ可以抑制多种冠状病毒对细... 为了寻找有效抗冠状病毒感染的治疗靶点,用CCK-8法和结晶紫法检测VPS34蛋白抑制剂PIKⅢ对细胞的敏感性,通过CCK-8法检测PIKⅢ抗病毒活性,通过病毒滴度及RT-PCR检测PIKⅢ对冠状病毒复制的影响。结果显示,PIKⅢ可以抑制多种冠状病毒对细胞的杀伤作用,提高细胞活性并且减少冠状病毒复制。VPS34蛋白抑制剂PIKⅢ对SARS-CoV-2、PEDV和TGEV 3种冠状病毒感染具有抑制作用,可以减少病毒复制,PIKⅢ可能是一种有效的抗冠状病毒药物。 展开更多
关键词 冠状病毒 自噬 Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶 PIKⅢ 抗病毒药物
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PCV3 Cap基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定 被引量：3
7
作者 姜宇航 徐一鸣 +6 位作者 许汪 杜寿文 宋利娜 陈竞 郝鹏飞 金宁一 李昌 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2112-2117,2128,共7页
试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒... 试验旨在获得具有天然构象且反应原性良好的猪圆环病毒3型(porcine circoviurs 3,PCV3)Cap蛋白。以本实验室保存的PCV3Cap基因为模板,设计不同引物扩增Cap基因,将其亚克隆至pEASY-Blunt载体上,验证正确后将目的基因分别克隆至杆状病毒表达载体pFastBacTM上(含有双启动子),获得含有2个PCV3Cap基因的重组质粒pFBD-P2C。将该重组质粒转化大肠杆菌DH10-BacTM感受态细胞当中,进行蓝白斑筛选,获得重组杆状质粒Bacmid P2C,利用脂质体转染至SF9细胞中进行病毒拯救,转染后72h,收取上清病毒液,盲传3代,收取SF9细胞应用间接免疫荧光法(IFA)及Western blot检测目的蛋白是否表达。结果显示,重组质粒pFBD-P2C酶切验证正确,重组杆粒Bacmid P2C构建成功,杆状病毒中能够表达PCV3Cap蛋白且能与His-tag抗体发生特异性反应,IFA鉴定出现特异性绿色荧光,表明成功表达了PCV3Cap蛋白且具有反应原性,为深入开展PCV3抗体制备、新型疫苗研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 重组杆状病毒 CAP蛋白 表达
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PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析 被引量：2
8
作者 张涵 解长占 +8 位作者 张世亨 李卓昕 李成辉 赵冠宇 马彬尧 尹革芬 鲁会军 金宁一 李太元 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第7期1272-1275,1281,共5页
从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将该毒株命名为YN—LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征，根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物，对YNI。Q株全基因进行扩增及测序，将测序结... 从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），将该毒株命名为YN—LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征，根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物，对YNI。Q株全基因进行扩增及测序，将测序结果依次拼接获得YN—LQ株的全基因序列，并进行序列的比对分析。结果显示：PRRsVYN—LQ株基因组全长为15320bp；将YN—LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析，发现YN—LQ株与JXAl的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99．0％，其氨基酸序列有15个位点发生了改变；GP5基因序列同源性为97．7％，其氨基酸序列有9个位点发生了改变；全基因的同源性为98．7％。证实该毒株为JXA1变异株，为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 序列测定 遗传进化分析
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寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定 被引量：2
9
作者 张涵 曹亮 +6 位作者 鲁会军 田明尧 孙文超 郭丹丹 汪伟 金宁一 李太元 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第7期681-684,690,共5页
目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZI... 目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因,用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a,构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,并对最适IPTG诱导浓度进行优化。结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确。用重组质粒转化DE3,当加入IPTG终浓度为2mmol/L,成功表达出分子质量单位(Mr)为56×103重组ZIKV E蛋白,与理论分子质量相符合。Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别。结论成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 寨卡病毒 E蛋白 原核表达 鉴定
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猪源IFN-λ3的克隆、表达及抗病毒活性分析 被引量：1
10
作者 陈竞 许汪 +6 位作者 宋利娜 郝鹏飞 姜宇航 付婷婷 金鑫 金宁一 李昌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第5期32-37,共6页
为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通... 为了解猪源IFN-λ3的体外抗病毒活性,本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞(CRL2845)中扩增获得猪源IFN-λ3基因(pIFN-λ3),并将pIFN-λ3基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pCDNA3.1-pIFN-λ3,利用脂质体转染293细胞。48 h后通过Western blot分析pIFN-λ3瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于PK15、MDCK细胞进行pIFN-λ3抗病毒活性分析。结果显示,本研究成功扩增获得pIFN-λ3基因,并在293细胞内成功表达;瞬时表达能够抑制表达绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus-green fluorescent protein,VSVG)在PK15、MDCK细胞上的增殖。本研究结果为深入研究猪源IFN-λ3在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用提供参考和依据。 展开更多
关键词 猪IFN-λ3 猪肺巨噬细胞 抗病毒活性
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重组腺病毒Ad-VT对肝癌的抑制作用
11
作者 李雅茹 杨霞 +11 位作者 朱羿龙 李文杰 刘子睿 尚超 宋高杰 李善智 修志儒 葛晨晨 李霄 李一权 金宁一 蔡锦顺 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2021年第12期1398-1403,共6页
目的探讨重组腺病毒Ad-VT对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外抑制作用。方法使用重组腺病毒Ad-VT、Ad-T、Ad-vp3以及Ad-mock感染HepG-2细胞,通过MTS检测重组腺病毒对HepG-2细胞的杀伤抑制作用;通过Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI以及JC-... 目的探讨重组腺病毒Ad-VT对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外抑制作用。方法使用重组腺病毒Ad-VT、Ad-T、Ad-vp3以及Ad-mock感染HepG-2细胞,通过MTS检测重组腺病毒对HepG-2细胞的杀伤抑制作用;通过Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI以及JC-1染色对重组腺病毒抑制HepG-2细胞的主要途径进行分析;通过构建体内裸鼠荷瘤模型,分析重组腺病毒对HepG-2细胞的体内抑瘤作用。结果Ad-VT可抑制HepG-2细胞的增殖,并呈时效和剂效关系,在100 MOI的剂量下,72 h时抑制率达最高值64.22%,与对照病毒Ad-T的50.52%和Ad-vp3的43.17%比较差异有统计学意义(P<0.05)。Ad-VT通过内源性凋亡途径引起HepG-2细胞的死亡。体内抑瘤试验中Ad-VT能够抑制肿瘤的生长,且能够延长小鼠的存活时间并提高存活率。结论Ad-VT能够诱导肝癌细胞凋亡,改变肝癌细胞线粒体膜电位,有效地抑制肝癌细胞增殖和肿瘤生长。 展开更多
关键词 人肝癌细胞 重组腺病毒 凋亡素 HEPG-2
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GII.P16-GII.2型诺如病毒VLPs的纯化研究
12
作者 程成 李秋璇 +8 位作者 白冰 张金鑫 李善智 李玥 李卓昕 王鹏 金宁一 鲁会军 韩继成 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2022年第12期1365-1368,共4页
目的诺如病毒(Norovirus)是一种重要的人畜共患病病毒,可感染人、猪、牛、犬等多种动物,引起诺如病毒病,每年给全球造成巨大的经济损伤。本研究基于AKTA纯化系统探索诺如病毒VLPs的纯化工艺。方法将诺如病毒重组杆状病毒接种到SF9细胞... 目的诺如病毒(Norovirus)是一种重要的人畜共患病病毒,可感染人、猪、牛、犬等多种动物,引起诺如病毒病,每年给全球造成巨大的经济损伤。本研究基于AKTA纯化系统探索诺如病毒VLPs的纯化工艺。方法将诺如病毒重组杆状病毒接种到SF9细胞中培养,通过Western blot、间接免疫荧光试验以及SDS-PAGE进行鉴定,对鉴定正确的细胞培养产物采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,并对层析柱的选择、层析缓冲液的pH值、洗脱液NaCI浓度等进行优化。基于优化后的参数或条件通过AKTA纯化系统纯化诺如病毒VLPs,分析纯化效果。结果经Western blot、间接免疫荧光、以及SDS-PAGE等鉴定,诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。采用阴、阳离子柱进行病毒的层析纯化,优化的纯化参数或条件为:阴离子纯化柱,层析缓冲液pH值为6.0,洗脱液NaCI浓度为0.2 mol/L。结论诺如病毒重组杆状病毒转染SF9细胞后表达诺如病毒VLPs。优化的AKTA纯化系统可用于诺如病毒VLPs的纯化。 展开更多
关键词 诺如病毒 病毒样颗粒 AKTA纯化系统 蛋白纯化
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表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选
13
作者 张克龙 郝鹏飞 +11 位作者 巫介棚 朱羿龙 许汪 韩继成 哈卓 杜寿文 花群义 曹琛福 郑敏 罗廷荣 金宁一 李昌 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第6期44-47,I0004,共5页
为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病... 为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性。PCR鉴定结果显示,VP 2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因。荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞。本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 重组痘苗病毒 BTV-16 VP2 EGFP 遗传稳定性
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广西JXA1-like谱系PRRSV分离株的致病性研究
14
作者 王政 解长占 +7 位作者 于桐 于成东 孟媛 李亭玉 于宁 鲁会军 金宁一 张雪梅 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2020年第9期1010-1014,共5页
目的探讨广西地区猪繁殖与呼吸综合征的流行毒株特征,了解JXA1-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病特性。方法取广西分离的JXA1-like谱系PRRSV毒株17-10-PI接种于4周龄健康仔猪,观察其临床表现、体温变化和病毒血症,并进行细胞因子... 目的探讨广西地区猪繁殖与呼吸综合征的流行毒株特征,了解JXA1-like谱系猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病特性。方法取广西分离的JXA1-like谱系PRRSV毒株17-10-PI接种于4周龄健康仔猪,观察其临床表现、体温变化和病毒血症,并进行细胞因子检测和病理组织学分析,了解该毒株的致病性。结果17-10-PI组试验仔猪出现典型的病毒感染症状,体温在攻毒后6~10 d体温持续高于40.0℃,9 d时达到峰值40.8℃,15 d时有1头试验仔猪死亡。17-10-PI株能在试验仔猪体内快速复制引起病毒血症,相关细胞因子不同程度升高,以IFN-α和IL-2升高更为显著。剖检和病理学检查显示,17-10-PI株可致明显的间质增生性肺炎和炎性细胞大量浸润等病理损伤。结论17-10-PI株具有较强的致病性,能引起相关细胞因子升高和肺组织损伤。该研究可为JXA1-like谱系毒株的防控与疫苗的研发提供理论基础。 展开更多
关键词 JXA1-like谱系 猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV) 致病性 病毒血症
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基孔肯雅病毒E2蛋白的原核表达及纯化
15
作者 郭丹丹 曹亮 +7 位作者 田明尧 鲁会军 孙文超 张涵 汪伟 刘云霞 金宁一 郭焱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2018年第9期936-940,共5页
目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成的E... 目的原核表达并纯化基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)E2主要结构蛋白,为预防CHIKV感染及亚单位疫苗的研究奠定基础。方法根据Gen Bank上公布的CHIKV基因序列合成E2基因,并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物并以合成的E2基因为模板,PCR扩增CHIKV E2,连接到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后进行纯化。结果重组原核表达质粒p ET-28a-CHIKV E2经双酶切鉴定构建正确,测序结果与原序列一致。表达的CHIKV E2融合蛋白相对分子质量约为47 000,可与His标签抗体特异性结合,纯化后纯度达95%以上。结论成功在大肠埃希菌中表达了CHIKV E2蛋白,纯化后蛋白纯度较高,为CHIKV亚单位疫苗的免疫试验奠定了基础。 展开更多
关键词 基孔肯雅病毒 原核表达 纯化
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非侵入性血流检测法辅助卒中后抑郁模型的建立
16
作者 李笨 严苏杭 +6 位作者 孙文超 肖朋朋 李楠 李昌 鲁会军 金宁一 王茂鹏 《动物医学进展》 北大核心 2021年第3期25-29,共5页
卒中后抑郁是脑卒中患者发病率最高的精神障碍性疾病,其发病机制复杂,缺乏有效治疗性药物。为了建立更高效的小鼠动物模型,以研究该病发生机制、评估药物疗效,通过改良手术方案,并用激光散斑血流成像系统对造模试验进行非侵入性血流检... 卒中后抑郁是脑卒中患者发病率最高的精神障碍性疾病,其发病机制复杂,缺乏有效治疗性药物。为了建立更高效的小鼠动物模型,以研究该病发生机制、评估药物疗效,通过改良手术方案,并用激光散斑血流成像系统对造模试验进行非侵入性血流检测法辅助构建卒中后抑郁小鼠模型。结果表明,该方法可在造模过程中,实时、准确判断给药位置及药物作用效果,经过蔗糖偏好试验、悬尾试验等行为学检测方法,证明激光散斑血流成像系统辅助方法能够有效监控手术过程,提升卒中后抑郁Balb/c小鼠模型建立的成功率。 展开更多
关键词 卒中后抑郁 小鼠模型 激光散斑血流成像系统
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人IFN-λ1的克隆表达及其在不同种属细胞中的抗病毒活性分析
17
作者 陈竞 许汪 +6 位作者 宋利娜 郝鹏飞 姜宇航 付婷婷 金鑫 金宁一 李昌 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第10期1166-1170,共5页
目的测定IFN-λ1在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等4种不同种属来源细胞中的抗病毒活性。方法利用RT-PCR技术从人结直肠腺癌细胞(CaCo2)中扩增获得人IFN-λ1 (HuIFN-λ1)基因,然后克隆至真核表达载体pCDNA3.1-Flag-HA中,通过质粒转化、阳... 目的测定IFN-λ1在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等4种不同种属来源细胞中的抗病毒活性。方法利用RT-PCR技术从人结直肠腺癌细胞(CaCo2)中扩增获得人IFN-λ1 (HuIFN-λ1)基因,然后克隆至真核表达载体pCDNA3.1-Flag-HA中,通过质粒转化、阳性菌落筛选、质粒提取及测序,获得重组质粒pCDNA3.1-HuIFN-λ1;利用脂质体将其转染293细胞,48 h后通过Western blot检测HuIFN-λ1瞬时表达情况,取转染后上清分别作用于CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK等四种不同种属来源细胞进行HuIFN-λ1抗病毒活性分析。结果从人结直肠腺癌细胞中扩增获得HuIFN-λ1基因,大小为600 bp,并在293细胞内成功表达HuIFN-λ1,表达产物能抑制VSVG在CaCo2、Vero、BHK-21、MDCK中的增殖,流式细胞仪检测经HuIFN-λ1处理的上述细胞荧光率分别为73.69%、80.12%、71.73%、69.47%。结论重组表达的人IFN-λ1蛋白对4种不同种属来源的细胞均存在一定的抗病毒活性,为研究人IFN-λ1在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机制及其应用奠定了基础。 展开更多
关键词 人IFN-λ1 人结直肠腺癌细胞 抗病毒活性
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重组猪源IFN-λ1植物乳杆菌的构建与表达验证
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作者 付婷婷 马彬尧 +6 位作者 王茂鹏 韩继成 许汪 陈竞 姜宇航 金宁一 李昌 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2019年第4期35-39,43,共6页
为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表... 为构建猪源3型干扰素(pIFN-λ1)的重组植物乳杆菌并进行验证。通过PCR方法扩增含有植物乳杆菌锚定信号肽的猪源IFN-λ1基因(pIFN-λ1),插入到pSIP411表达载体电转入到中间克隆宿主菌NZ3900中,获得重组质粒pSIP-pIFN-λ1;再次电转入到表达宿主植物乳杆菌Lp18获得重组植物乳杆菌;制备重组植物乳杆菌并验证其表达。结果显示,成功扩增出650bp目的条带,电转入植物乳杆菌Lp18中成功构建重组Lp18:pSIP-pIFN-λ1。WesternBlot、免疫荧光和流式细胞分析等方法验证重组蛋白pIFN-λ1的表达,获得阳性结果,阳性率为22.96%,且进一步证明其展示并锚定在植物乳杆菌表面。本试验成功构建了1株能稳定表达猪源IFN-λ1蛋白的重组植物乳杆菌,为猪源IFN-λ1的开发应用研究提供理论基础。 展开更多
关键词 3型干扰素 植物乳酸菌 构建与表达
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猪圆环病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及应用 被引量：13
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作者 李卓昕 温树波 +9 位作者 孙文超 赵冠宇 庄忻雨 解长占 张赫 肖朋朋 韩继成 高旭 鲁会军 金宁一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第9期934-938,944,共6页
目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PC... 目的建立针对PCV3的操作简单、重复性好、灵敏度较高的检测方法。方法利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段(312bp),将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒。优化反应条件,建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法,并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×10~1~4.24×10~8拷贝/μl范围内呈良好线性关系,其相关系数为0.996,斜率为-4.384。该方法特异性强,与PRRSV、FMDV、JEV、PCV2及PRV均无交叉反应;敏感性为4.24×10~1拷贝/μl,比常规PCR方法高10倍;组间和组内重复试验的变异系数均小于2%。利用实时荧光定量PCR方法对采集的155份猪肺组织进行检测,阳性率为36.13%,高于普通PCR阳性检出率的32.25%。结论建立的PCV3SYBR GreenⅠReal-time PCR方法敏感、特异,可用于猪体PCV3感染的快速检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 建立 应用
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猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立 被引量：12
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作者 孙文超 刘立明 +8 位作者 赵翠青 汪伟 赵冠宇 曹亮 张赫 庄忻雨 韩继成 鲁会军 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期442-445,452,共5页
采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-... 采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×10^9-8.80×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×10^1 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。 展开更多
关键词 猪细小病毒6型 SYBR Green I 荧光定量PCR
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