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高质量人体粪便细菌16S rDNA V3区扩增方法 被引量：2
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作者 贾彦 江岩 +4 位作者 明珠 赵培 庞广昌 闫亚丽 陈庆森 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期456-462,共7页
[目的]为获得应用于二代测序的高质量16S r DNA V3区PCR产物。[方法]以从人体粪便中提取微生物总DNA为模板,通过梯度PCR和touchdown PCR技术确定了循环条件,并通过调整反应体系中的相关浓度参数以使扩增结果得到优化。[结果]最终确定的... [目的]为获得应用于二代测序的高质量16S r DNA V3区PCR产物。[方法]以从人体粪便中提取微生物总DNA为模板,通过梯度PCR和touchdown PCR技术确定了循环条件,并通过调整反应体系中的相关浓度参数以使扩增结果得到优化。[结果]最终确定的循环条件为预变性95℃3 min,变性95℃30 s,退火69℃-62℃每个循环退火温度降0.5℃,退火时间30 s,延伸72℃60 s,共15个循环;变性95℃30 s,退火62℃30 s,延伸72℃60 s,共15个循环,最后72℃延伸5 min。反应体系为：在50μL体系中DNA模板量10-25 ng,pfu酶0.25-0.5 U,正反向引物均为0.06-0.1μmol/L,d NTPs浓度0.2-0.4 mmol/L,Mg2＋浓度2-2.5 mmol/L。[结论]梯度PCR与touchdown PCR相结合可快速确定最佳的退火温度以及循环条件,通过调整反应体系中浓度参数可以解决扩增中一些问题。 展开更多
关键词 肠道细菌 16S RDNA V3区 PCR 优化
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