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嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建
被引量：
1
1
作者
黄晨燕
郑茹萍
+5 位作者
黎钟秀
余云钦
罗雨琦
周建双
张飞萍
吴松青
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第8期1612-1623,共12页
[目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进...
[目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA(pGHKW2)以及HasA(pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。[结果] CSLH88菌株培养2-4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2(GenBank:MK562405)和pGHKW4(GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。[结论]通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。
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关键词
松墨天牛
嗜虫耶尔森氏菌
外分泌表达系统
绿色荧光蛋白
原文传递
PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立
被引量：
1
2
作者
陈如敬
周伦江
+7 位作者
吴学敏
车勇良
王晨燕
王隆柏
黄晓凤
严山
刘玉涛
魏宏
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2017年第10期15-20,29,共7页
【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋...
【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD450<0.345 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。
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关键词
猪繁殖与呼吸综合征病毒
N蛋白
GP5蛋白
抗原表位
串联表达
间接ELISA
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职称材料
题名
嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建
被引量：
1
1
作者
黄晨燕
郑茹萍
黎钟秀
余云钦
罗雨琦
周建双
张飞萍
吴松青
机构
福建农林大学林学院
厦门大学环境与生态学院
出处
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第8期1612-1623,共12页
基金
国家重点研发计划课题(2017YFD0600105)
国家自然科学基金(31601905)
+5 种基金
福建省科技厅自然科学基金(2016J01097)
福建省科技计划项目(2018N5002)
福建农林大学科研基金(xjq201614)
福建农林大学林学院林学高峰学科项目(71201800720,71201800753,71201800779)
福建省大学生创新创业训练计划项目(201810389102)
福建省林业科学研究项目[Minlinke(2017)03]~~
文摘
[目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA(pGHKW2)以及HasA(pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。[结果] CSLH88菌株培养2-4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2(GenBank:MK562405)和pGHKW4(GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。[结论]通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。
关键词
松墨天牛
嗜虫耶尔森氏菌
外分泌表达系统
绿色荧光蛋白
Keywords
Monochamus alternatus Hope
Yersinia pestis
exocrine expression system
green fluorescent protein
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
S763.18 [农业科学—森林保护学]
原文传递
题名
PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立
被引量：
1
2
作者
陈如敬
周伦江
吴学敏
车勇良
王晨燕
王隆柏
黄晓凤
严山
刘玉涛
魏宏
机构
福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心
出处
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2017年第10期15-20,29,共7页
基金
福建省属公益类项目(2014R1023-16
2014R1023-13)
福建省畜禽疫病防控技术重大研发平台项目(2014N2003)
文摘
【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD450<0.345 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。
关键词
猪繁殖与呼吸综合征病毒
N蛋白
GP5蛋白
抗原表位
串联表达
间接ELISA
Keywords
porcine reproductive and respiratory syndrome virus~ N proteins
GP5 proteins
antigen epitopes
tandem expression
indirect ELISA
分类号
S858.28 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建
黄晨燕
郑茹萍
黎钟秀
余云钦
罗雨琦
周建双
张飞萍
吴松青
《微生物学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
1
原文传递
2
PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立
陈如敬
周伦江
吴学敏
车勇良
王晨燕
王隆柏
黄晓凤
严山
刘玉涛
魏宏
《西北农林科技大学学报（自然科学版）》
CSCD
北大核心
2017
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