通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子(pE/L)、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp(Locus of X-over P1)序列的表达盒构建穿梭质粒pTE-EGFP。利用pTE-EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过对绿...通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子(pE/L)、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp(Locus of X-over P1)序列的表达盒构建穿梭质粒pTE-EGFP。利用pTE-EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E3L基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE--EGFP+。利用rTTVV-TE--EGFP+和含有Cre(Cyclization recombination)重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--,并利用聚合酶链式反应(PCR)对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE--中无E3L基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。展开更多
文摘通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子(pE/L)、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp(Locus of X-over P1)序列的表达盒构建穿梭质粒pTE-EGFP。利用pTE-EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E3L基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE--EGFP+。利用rTTVV-TE--EGFP+和含有Cre(Cyclization recombination)重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--,并利用聚合酶链式反应(PCR)对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE--中无E3L基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。
