环介导等温扩增技术的研究进展 被引量：35

1

作者 黄火清 郁昂 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期90-94,共5页

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物,不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应,目... 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新式核酸扩增技术,它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶和2对特殊设计的引物,不需要反复的温度循环和昂贵的仪器设备,在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应,目前已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测,及动物胚胎性别的鉴定。该文总结了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用,最后指出LAMP目前存在的不足以及采取的相应措施,并对其发展前景进行了展望。 展开更多

关键词 环介导等温扩增 核酸扩增 应用

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增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量 被引量：12

2

作者 罗会颖 黄火清 +5 位作者 柏映国 王亚茹 杨培龙 孟昆 袁铁铮 姚斌 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期528-533,共6页

为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-... 为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。 展开更多

关键词 植酸酶 载体改造 拷贝数增加 高效表达

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植酸酶发展现状和研究趋势 被引量：17

3

作者 丁强 杨培龙 +2 位作者 黄火清 王亚茹 姚斌 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2010年第3期27-33,共7页

植酸酶作为一种新型的饲料添加剂已经得到越来越多的重视和应用。其可以提高饲料中磷和其他成分的利用率,并减轻环境污染。综述了新型酶制剂的筛选、高效表达和应用等方面的进展,并对进一步的研究开发趋势进行了分析。

关键词 植酸酶 饲料 应用 高通量筛选 高效表达

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角蛋白酶的研究与应用前景 被引量：9

4

作者 杨连 曹永洪 +1 位作者 杨培龙 黄火清 《生物技术进展》 2015年第1期29-34,共6页

角蛋白酶(keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,其来源广泛,多种微生物在羽毛降解过程中均可产生角蛋白酶。不同菌种来源的角蛋白酶,其结构、理化性质、活性和底物也不同。其在饲料行业、制革工业和环境废弃物处理等多个方面... 角蛋白酶(keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,其来源广泛,多种微生物在羽毛降解过程中均可产生角蛋白酶。不同菌种来源的角蛋白酶,其结构、理化性质、活性和底物也不同。其在饲料行业、制革工业和环境废弃物处理等多个方面具有广泛的应用前景,能够产生巨大的社会效益和经济效益。本文系统总结了角蛋白酶的来源、分类、理化性质、作用机理及其在基因工程研究等方面的一些最新进展,简要介绍了其应用研究现状,并展望了角蛋白酶的应用前景。 展开更多

关键词 角蛋白 角蛋白酶 羽毛降解 应用领域

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一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质 被引量：9

5

作者 密士军 柏映国 +6 位作者 孟昆 王亚茹 姚斌 史秀云 黄火清 张宇宏 石鹏君 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期156-160,共5页

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此... 从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag+的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag+的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。 展开更多

关键词 丝状真菌 青霉 Α-半乳糖苷酶 纯化 酶学性质

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β-甘露聚糖酶Man5A和木聚糖酶Tlxyn11B的融合表达 被引量：6

6

作者 孔海洋 蒋肖 +2 位作者 王苑 黄火清 罗会颖 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1849-1858,共10页

甘露聚糖酶和木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶,在食品、饲料、纺织、造纸等工业应用广泛且通常搭配使用。文中将蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的性质优良的甘露聚糖酶编码基因man5A的CBM(Carbohydrate-bindingmodule)编... 甘露聚糖酶和木聚糖酶是主要的半纤维素降解酶,在食品、饲料、纺织、造纸等工业应用广泛且通常搭配使用。文中将蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的性质优良的甘露聚糖酶编码基因man5A的CBM(Carbohydrate-bindingmodule)编码区去除,留下连接区和催化区,并将木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟区编码序列与man5A的连接区进行融合,形成Tlxyn11B-linker-man5A融合基因,并在毕赤酵母中成功表达,获得了融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。Tlxyn11B、不含CBM区的Man5A和Tlxyn11B-Man5A的理论分子量分别为21.6kDa、41.0 kDa、62.6 kDa。对纯化后的融合蛋白进行了性质分析,融合蛋白同时具有高的木聚糖酶和甘露聚糖酶活性。融合后的木聚糖酶的最适温度为70℃,较单独表达时提高了5℃。甘露聚糖酶的最适温度为90℃,与融合前一致。融合后的木聚糖酶热稳定性明显提高,60℃处理1 h剩余48%的酶活力,单独表达的木聚糖酶60℃处理20 min仅剩余20%的酶活力。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的最适pH分别为4.0和5.0,较单独表达时分别提高了0.5和1.0个单位,融合后酶的作用pH范围有所拓宽。融合前后的蛋白均具有较好的pH稳定性。融合后木聚糖酶和甘露聚糖酶的比活分别为1 784.3 U/mg和1 639.6 U/mg,较单独表达时比活(8 300 U/mg和1 979 U/mg)降低,与融合酶分子量增大相关。融合后的木聚糖酶和甘露聚糖酶的Km值分别为1.2 mg/mL和1.7 mg/mL, Vmax分别为2 000.0μmol/(min·mg)和2 831.6μmol/(min·mg)。综合其性质特点,融合木聚糖酶和甘露聚糖酶在饲料、食品等工业生产中有较大应用潜力,并为酶的性能改良提供了新的思路。 展开更多

关键词 甘露聚糖酶 木聚糖酶 融合表达 毕赤酵母 性质分析

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来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达 被引量：4

7

作者 黄火清 罗会颖 +5 位作者 柏映国 王亚茹 姚斌 孟昆 袁铁铮 杨培龙 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期945-950,共6页

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框... 柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。 展开更多

关键词 高比活植酸酶 基因改造 毕赤酵母 高效表达

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化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响

8

作者 梁丽存 刘文龙 +3 位作者 刘晓青 姚斌 黄火清 杨浩萌 《生物技术进展》 2024年第4期586-593,共8页

某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PC... 某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PCR验证,检测8种化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响。结果发现,与零添加对照组相比,在原生质体转化过程中,添加苯菌灵(benomyl)、RS-1、香草醛(vanillin)和氯丙嗪(chlorpromazine),同源重组效率分别达到85.45%、60.90%、59.45%、65.95%,比对照组提高了18.05%、9.35%、7.9%、14.4%;当苯菌灵与其他试剂叠加使用时,同源重组效率进一步提高,最高可达97.92%。因此,化学试剂在原生质体转化中的应用为提高丝状真菌的基因编辑效率提供了新的思路。 展开更多

关键词 化学试剂 同源重组效率 塔宾曲霉

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毕赤酵母外源蛋白分泌及折叠途径的改良进展

9

作者 路泽群 刘宁 +2 位作者 张红莲 王苑 黄火清 《中国农业科技导报》 CSCD 北大核心 2024年第1期18-27,共10页

工业、农业和医药等领域常用的活性蛋白和工业酶大多数通过异源表达系统获得。毕赤酵母(Pichia pastoris)是优秀的外源蛋白表达宿主之一,以毕赤酵母为宿主的表达系统具有遗传稳定性好、翻译后修饰、蛋白表达和分泌水平高及生产成本低等... 工业、农业和医药等领域常用的活性蛋白和工业酶大多数通过异源表达系统获得。毕赤酵母(Pichia pastoris)是优秀的外源蛋白表达宿主之一,以毕赤酵母为宿主的表达系统具有遗传稳定性好、翻译后修饰、蛋白表达和分泌水平高及生产成本低等优点,但在高效表达过程中外源蛋白过量聚集会导致目标蛋白不能正确折叠和有效分泌,从而影响蛋白表达水平。概述了通过信号肽优化、分子伴侣优化以及融合蛋白表达等分泌及折叠途径的改良,从而促进外源蛋白高效表达的研究进展。 展开更多

关键词 毕赤酵母 分泌折叠途径 分泌信号肽 分子伴侣 融合表达

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提高丝状真菌精准基因编辑效率的策略

10

作者 杨浩萌 梁丽存 +4 位作者 宋祖洹 徐欣欣 罗会颖 姚斌 黄火清 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1425-1440,共16页

基因编辑技术的应用使对丝状真菌进行高效、精准的基因改造成为可能。然而,在实际实验操作过程中,仍然存在很多影响因素,导致同源重组介导的精准基因编辑的效率很低。本文对目前提高丝状真菌精准编辑效率的方法进行了总结,使基因编辑方... 基因编辑技术的应用使对丝状真菌进行高效、精准的基因改造成为可能。然而,在实际实验操作过程中,仍然存在很多影响因素,导致同源重组介导的精准基因编辑的效率很低。本文对目前提高丝状真菌精准编辑效率的方法进行了总结,使基因编辑方法更好地应用于丝状真菌的菌种改造。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas 精准编辑 同源重组 非同源末端连接

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双功能脱毒用酿酒酵母的构建

11

作者 王懿珺 黄火清 苏小运 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期226-233,共8页

饲料中真菌毒素污染普遍,已经成为目前阻碍畜禽健康养殖的一大重要因素。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)影响范围广、危害大,开发新方法用于饲料真菌毒素的脱毒是目前的研究热点。本研究分离... 饲料中真菌毒素污染普遍,已经成为目前阻碍畜禽健康养殖的一大重要因素。真菌毒素种类繁多,其中黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)影响范围广、危害大,开发新方法用于饲料真菌毒素的脱毒是目前的研究热点。本研究分离并比较了4株不同的酿酒酵母菌株对AFB1的吸附能力,发现较其他方式(加热和甘露聚糖酶处理)和菌株,经葡聚糖酶处理后的酿酒酵母CEN.PK菌株对AFB1吸附率最高,可达53.3%±8.2%。随后,再以该菌株为宿主菌组成型表达来自于约氏黄杆菌的肌醇氧化酶基因FjMiox,经改造后工程菌可将1 g·L^(-1)的肌醇全细胞转化为0.273 g·L^(-1)的葡萄糖醛酸。在动物肝脏内,葡萄糖醛酸可经酶催化和真菌毒素结合增强其水溶性使其易于排除,因此可合成葡萄糖醛酸的工程化酿酒酵母结合了肠道内吸附脱毒和肝脏内结合解毒2种功能,为解决黄曲霉毒素在饲料中的污染提供了新的可能解决方案。 展开更多

关键词 黄曲霉毒素 酿酒酵母 肌醇氧化酶 葡萄糖醛酸 毒素脱毒

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白地霉ch-3低温脂肪酶基因的克隆与表达 被引量：3

12

作者 付建红 姚斌 +2 位作者 杨浩萌 黄火清 石玉瑚 《生物技术》 CAS CSCD 2007年第5期25-29,共5页

目的:脂肪酶是世界主要工业用酶制剂之一,用基因工程方法克隆与表达白地霉(Geotrichum candidum)ch-3菌株的低温脂肪酶基因。方法:用PCR方法从白地霉ch-3的总DNA中扩增得到一种低温脂肪酶基因lip,将PCR产物连接到pBluescriptⅡSK(+)载体... 目的:脂肪酶是世界主要工业用酶制剂之一,用基因工程方法克隆与表达白地霉(Geotrichum candidum)ch-3菌株的低温脂肪酶基因。方法:用PCR方法从白地霉ch-3的总DNA中扩增得到一种低温脂肪酶基因lip,将PCR产物连接到pBluescriptⅡSK(+)载体上,测序证明正确后再将基因lip插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9α中,含有目的基因的重组质粒在毕赤酵母中进行诱导表达。结果:毕赤酵母成功表达了lip基因,其活性为37U/mL。SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶蛋白相对分子质量约62kDa,比推测分子量大,lip的表达产物可能被糖基化修饰。初步研究表明:重组脂肪酶最适温度为35℃,在0℃仍可保持66%的相对酶活性,对热敏感。结论:实现了低温脂肪酶在毕赤酵母的成功表达,为进一步研究低温酶催化机制和工业化应用打下基础。 展开更多

关键词 白地霉ch-3 低温脂肪酶 基因克隆 巴斯德毕赤酵母 表达

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MECE:基于深度神经网络及进化分析提高糖苷水解酶的催化效率 被引量：1

13

作者 刘汗青 关菲菲 +8 位作者 刘拓宇 杨丽鑫 范灵熙 刘晓青 罗会颖 伍宁丰 姚斌 田健 黄火清 《Science Bulletin》 SCIE EI CAS CSCD 2023年第22期2793-2805,M0006,共14页

糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)在各个行业广泛应用,其需求量不断增加.然而,如何提高酶的催化效率仍然是一个挑战.本文开发了基于深度神经网络和分子进化的策略(MECE)预测提高糖苷水解酶催化活性的突变体.作者首先从CAZy数据库... 糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)在各个行业广泛应用,其需求量不断增加.然而,如何提高酶的催化效率仍然是一个挑战.本文开发了基于深度神经网络和分子进化的策略(MECE)预测提高糖苷水解酶催化活性的突变体.作者首先从CAZy数据库中收集整理了119个糖苷水解酶家族的蛋白序列,建立了能够识别糖苷水解酶家族和功能残基的深度学习模型DeepGH,通过10倍交叉验证结果显示DeepGH模型的预测准确率为96.73%.随后利用梯度加权类激活图谱(Grad-CAM)方法提取分类相关特征,结合序列进化信息对突变体进行设计最后获得了具有7个氨基酸突变位点的壳聚糖酶突变体CHIS1754-MUT7.实验结果表明,CHIS1754-MUT7的k_(cat)/K_m是野生型的23.53倍.该策略计算效率高,实验成本低,具有显著的优势,为酶催化效率的智能设计提供了一种新的途径,具有广泛的应用前景. 展开更多

关键词 MECE Deep learning Catalytic efficiency Glycoside hydrolases Feature extraction

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高比活木聚糖酶XYN-W及其突变体在酵母中的高效表达 被引量：3

14

作者 罗建杰 王亚茹 +5 位作者 袁铁铮 柏映国 黄火清 罗会颖 姚斌 范云六 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2010年第5期80-85,共6页

将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋... 将来源于瘤胃真菌Neocallimastix frontalis的高比活木聚糖酶基因xyn-w整合到毕赤酵母表达载体pPIC9上,通过电击转化得到重组转化子。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,木聚糖酶基因xyn-w得到了高效分泌表达,在5 L发酵罐中木聚糖酶蛋白表达量达到1 mg/mL,酶活性达到13 000 IU以上。XYN-W的C端57个氨基酸序列为连接序列和锚定区域,利用PCR方法将此段序列去除,得到截短的木聚糖酶序列xyn-m。用相同方法构建高效表达XYN-M蛋白的毕赤酵母工程菌株,表达产物经纯化后进行酶学性质测定,结果表明,其比活为19 856.6 IU/mg,Kcat值为4 433.8 s-1,与纯化的XYN-W蛋白(比活性13 795.3 IU/mg、Kcat值2 717.1 s-1)相比,分别提高了43.9%和63.2%。 展开更多

关键词 木聚糖酶 毕赤酵母 XYN-W 高效表达 比活性改良

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来源于云斑天牛肠道细菌Pseudomonas sp. TN06的β-折叠桶植酸酶基因phyA06的克隆、表达和酶学性质研究 被引量：2

15

作者 邵弨 郑长永 +4 位作者 韩杏 张蕊 周峻沛 黄火清 杨培龙 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期60-66,77,共7页

从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因（phyA06）,开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为... 从云斑天牛肠道中筛选到一株产植酸酶活性较高的假单胞菌Pseudomonas sp.TN06。采用简并PCR和TAIL-PCR的方法获得一个新的β-折叠桶植酸酶基因（phyA06）,开放阅读框全长1 902 bp,编码633个氨基酸和1个终止密码子,预测其前23个氨基酸为信号肽,含有两个β-折叠桶结构域。将phyA06基因在大肠杆菌中表达,重组蛋白经镍柱纯化后达到电泳纯。纯化后的重组酶最适pH为7.0,在pH 6.0-10.0的条件下具有很好的稳定性;最适温度为55℃,热稳定性良好。同时,该酶在低温下仍保持一定活力,甚至0℃仍有活性。该植酸酶具有应用于水产饲料行业的潜在价值。 展开更多

关键词 植酸酶 酶学性质 假单胞菌

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芽孢杆菌β-折叠桶植酸酶的原核可溶性表达优化及包涵体复性研究 被引量：2

16

作者 李倩倩 李中媛 +5 位作者 冯舵 黄火清 韩翠晓 杨培龙 姚斌 高伟 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期49-55,共7页

目的:来源于芽孢杆菌的β-折叠桶植酸酶基因PhyH,截去N端120个碱基编码的40个氨基酸后,成功构建了原核表达体系,通过两种方法分别得到有活性的目的蛋白PhyHT,并通过进一步纯化提高目的蛋白的纯度。方法:通过分子伴侣共表达系统提高目的... 目的:来源于芽孢杆菌的β-折叠桶植酸酶基因PhyH,截去N端120个碱基编码的40个氨基酸后,成功构建了原核表达体系,通过两种方法分别得到有活性的目的蛋白PhyHT,并通过进一步纯化提高目的蛋白的纯度。方法:通过分子伴侣共表达系统提高目的蛋白的可溶性表达,并通过包涵体复性研究,从包涵体中制备出有活性的目的蛋白。结果:(1)目的蛋白PhyHT主要以包涵体形式存在于沉淀中;(2)通过优化表达条件,降低温度和诱导剂浓度均不能明显改善包涵体问题,通过构建分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pTf16 4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET28b-PhyHT共表达),筛选能提高目的蛋白可溶性表达的分子伴侣质粒;(3)包涵体经过复性和进一步的纯化,得到了高纯度的有生物活性的目的蛋白。 展开更多

关键词 β-折叠桶植酸酶PhyHT 分子伴侣 可溶性表达 包涵体 蛋白纯化

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蜂房哈夫尼菌植酸酶基因appA的克隆、表达及酶学性质研究 被引量：2

17

作者 谷维娜 黄火清 +4 位作者 杨培龙 罗会颖 孟昆 王亚茹 姚斌 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期1017-1021,共5页

从蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）中克隆获得一个植酸酶编码基因appA，该基因全长1335bp，编码444个氨基酸，其中前33个氨基酸为信号肽，成熟蛋白的理论分子量为45．2kD。将基因appA克隆到大肠杆菌E．coli表达载体pET-22b（＋），并在大... 从蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）中克隆获得一个植酸酶编码基因appA，该基因全长1335bp，编码444个氨基酸，其中前33个氨基酸为信号肽，成熟蛋白的理论分子量为45．2kD。将基因appA克隆到大肠杆菌E．coli表达载体pET-22b（＋），并在大肠杆菌中表达，表达产物具有植酸酶活性。对表达的酶蛋白进行纯化，并初步研究了该酶的酶学性质，结果表明：酶的作用最适pH值为4．5；在pH2．0～10．0范围内，酶活性保留80％以上；酶的作用最适温度为60℃；酶的比活性为356．7U／mg，酶动力学分析表明其K。为0．49mmol／L，Vmax为238U／mg；该酶对胰蛋白酶和胃蛋白酶有一定的抗性。该研究为哈夫尼菌属来源植酸酶的首次报道。 展开更多

关键词 植酸酶 基因表达 纯化 酶学性质

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利用透明颤菌血红蛋白在低氧条件下提高毕赤酵母中植酸酶的表达 被引量：2

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作者 唐辉桂 黄火清 +3 位作者 罗会颖 王亚茹 杨培龙 姚斌 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 2008年第3期84-89,共6页

为了提高毕赤酵母(Pichia pastoris)中重组植酸酶的表达,在来源于Pichia stipitis的低氧诱导启动子PsADH2控制下,进行了透明颤菌血红蛋白基因vgb在重组P.pastoris中与植酸酶的共表达研究。结果表明,PsADH2启动子在低氧条件下被诱导启动... 为了提高毕赤酵母(Pichia pastoris)中重组植酸酶的表达,在来源于Pichia stipitis的低氧诱导启动子PsADH2控制下,进行了透明颤菌血红蛋白基因vgb在重组P.pastoris中与植酸酶的共表达研究。结果表明,PsADH2启动子在低氧条件下被诱导启动,表达的血红蛋白VHb对P.pastoris宿主细胞生长无明显影响,但使重组P.pastoris中共表达的植酸酶APPA活性提高了3倍。 展开更多

关键词 PsADH2启动子 透明颤菌血红蛋白VHb 低氧诱导 植酸酶 毕赤酵母

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解淀粉芽孢杆菌淀粉酶催化活力改良及其在枯草芽孢杆菌中的高效表达 被引量：2

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作者 邱锦 黄火清 +1 位作者 姚斌 罗会颖 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期134-143,共10页

α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1, 4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具... α-淀粉酶(α-amylase)是一类作用于淀粉内部水解其α-1, 4 糖苷键从而将淀粉水解为糊精、低聚糖和单糖的酶。该类酶已被广泛应用于面包生产及洗涤等工艺中。从分子水平上改造淀粉酶,以提高水解活力及催化效率,已经成为多年的目标,也具有重要的研究意义。以目前广泛应用的来源于解淀粉芽孢杆菌的中温中性淀粉酶 BAMYA 出发,通过理性设计在该淀粉酶的C 端结构域设计突变位点,利用定点突变提高其水解活力,并在枯草芽孢杆菌中实现高效表达。野生型酶 BAMYA 的最适作用温度和 pH 分别为 55℃和 6.0,比活为 6 835 U/mg。突变体 BAMYA-L473K/K474H/N475K 最适作用温度为 60℃,较野生型提高了 5℃,作用的最适 pH 没有发生变化。突变体比活为 10 148 U/mg,比野生型提高 48%。野生型 BAMYA 和突变体 BAMYA-L473K/K474H/N475K 的 Km 值、催化效率分别为 3.58 mg/mL 和 2.21 mg/mL,以及 1 577 mL/(s·mg)和 4 760 mL/(s·mg)。催化效率较野生型相比提高了 2 倍以上。该突变体应用于工业生产可有效提高其水解效率,降低应用成本。 展开更多

关键词 Α-淀粉酶 定点突变 枯草芽孢杆菌 催化效率

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美洲拟鲽抗菌肽Pleurocidin在大肠杆菌中的高效分泌表达及优化 被引量：2

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作者 徐雪姣 查向东 +5 位作者 车媛媛 马利娟 吴思群 杨培龙 黄火清 姚斌 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期365-374,共10页

为在大肠杆菌中分泌表达Pleurocidin,并提高融合蛋白的分泌效率,将Pleurocidin基因和Cherry DNA序列通过平末端连接融合,再将融合基因整合到p ET22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3);乳糖诱导表达。成功构建含p ET22b(+)-CP重组质粒的... 为在大肠杆菌中分泌表达Pleurocidin,并提高融合蛋白的分泌效率,将Pleurocidin基因和Cherry DNA序列通过平末端连接融合,再将融合基因整合到p ET22b(+)载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3);乳糖诱导表达。成功构建含p ET22b(+)-CP重组质粒的基因工程菌,用乳糖诱导获得高效表达。在诱导16 h时加入甘氨酸可以显著提高融合蛋白Cherry-Pleurocidin的分泌效率。用稀盐酸水解融合蛋白的酸敏感位点,再进一步分离纯化即得到r-Pleurocidin,其对大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌BS168具有明显的抑菌活性。结果表明成功构建了高效表达Pleurocidin的大肠杆菌基因工程菌,获得有活性的r-Pleurocidin。 展开更多

关键词 PLEUROCIDIN 分泌表达 Asp-Pro酸敏感位点 抑菌活性

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