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用Sleeping Beauty转座子筛选肺癌相关基因及功能研究
1
作者 朱祥平 高增鸿 +3 位作者 马若骛 汪瑾 刘颖 郭雅彬 《岭南现代临床外科》 2023年第2期118-126,134,共10页
目的探讨睡美人(SB)转座子筛选肺癌相关基因的应用。方法采用Sleeping Beauty转座子插入T2/Onc盒子(T2/Onc cassette)诱变人支气管上皮细胞(HBEC)的模型,挑选阳性克隆,高通量测序筛选共同插入位点(CIS)及候选基因。在非小细胞肺癌(NSCLC... 目的探讨睡美人(SB)转座子筛选肺癌相关基因的应用。方法采用Sleeping Beauty转座子插入T2/Onc盒子(T2/Onc cassette)诱变人支气管上皮细胞(HBEC)的模型,挑选阳性克隆,高通量测序筛选共同插入位点(CIS)及候选基因。在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系NCI⁃H1299中验证筛选出的COL11A1基因功能,采用CCK⁃8细胞增殖实验等检测NCI⁃H1299细胞系敲低COL11A1前后的增殖能力及其对顺铂的敏感性变化,采用Transwell细胞迁移、侵袭实验比较其迁移、侵袭能力变化。结果使用转座子筛选中通用的蒙特卡洛模拟法确定CIS,以P<0.05为界,共找到252个CIS,包括675个候选基因。结果显示,筛选出的COL11A1基因可以促进NCI⁃H1299细胞系增殖(P<0.01)、迁移(P<0.001)、侵袭(P<0.001)并介导其顺铂耐药(P<0.001)。结论本研究证明了使用SB转座子插入T2/Onc诱变HBEC的模型能够很好地筛选出肺癌相关基因,并证实了COL11A1可以促进NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭并介导顺铂耐药及上皮间质转换。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 睡美人转座子 基因筛选 COL11A1
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哈维氏弧菌qnr基因的克隆及原核表达条件优化 被引量：4
2
作者 周维 汤菊芬 +4 位作者 高增鸿 甘桢 简纪常 吴灶和 丁燏 《广东海洋大学学报》 CAS 2016年第1期93-97,共5页
根据Gen Bank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr序列,将其插入p ET-32a质粒,构建原核表达载体p ET32-qnr,并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明,哈维氏弧菌qnr全长651 bp,编码216个氨基酸;重组... 根据Gen Bank中公布的哈维氏弧菌qnr基因序列设计引物扩增哈维氏弧菌qnr序列,将其插入p ET-32a质粒,构建原核表达载体p ET32-qnr,并对诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行优化。结果表明,哈维氏弧菌qnr全长651 bp,编码216个氨基酸;重组蛋白优化条件为于28℃、IPTG浓度为0.05 mmol/L条件下诱导6 h。 展开更多
关键词 哈维氏弧菌 QNR基因 原核表达 优化
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细胞培养中“黑胶虫”污染的检测及防治 被引量：4
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作者 周怡婷 高增鸿 +3 位作者 杨嘉文 汪瑾 郭雅彬 马广伟 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2020年第1期61-68,共8页
很多国内的细胞培养实验室受到"黑胶虫"(或称为"胶虫"、"焦虫")污染的困扰,类似的污染在国外通常称为"纳米细菌"(nanobacteria)污染,但"黑胶虫"/纳米细菌究竟是何物种抑或是一种非... 很多国内的细胞培养实验室受到"黑胶虫"(或称为"胶虫"、"焦虫")污染的困扰,类似的污染在国外通常称为"纳米细菌"(nanobacteria)污染,但"黑胶虫"/纳米细菌究竟是何物种抑或是一种非生命颗粒,至今还没有定论.我们将细胞培养中的污染物从培养基中分离出来,进行培养和形态学观察,并利用16S r DNA鉴定技术及VITEK-2微生物鉴定系统对"黑胶虫"进行鉴定,最后通过抗生素敏感试验及细胞结晶紫染色技术筛选出抑制"黑胶虫"增殖的抗生素及可用于细胞培养的工作浓度.形态学观察结果显示:"黑胶虫"在普通倒置显微镜下呈点状或片状;电镜下展示为杆状,长1 300~1 600 nm,宽400~500 nm;在激光共聚焦扫描显微镜400倍镜下进行原地"布朗运动". 16 S rDNA鉴定及VITEK-2微生物鉴定系统结果显示:本实验室分离的"黑胶虫"为一株短波单胞菌属(Brevundimonas)的新菌株,该菌株与Brevundimonas diminuta的相似性为97.8%,与Brevundimonas faecalis的相似性为98.1%.抗生素敏感试验结果显示:"黑胶虫"对氯霉素(25 mg/L)、红霉素(200 mg/L)和四环素(2.5 mg/L)敏感,对氨苄青霉素(50 mg/L)、嘌呤霉素(2 mg/L)、青霉素-链霉素双抗(100×)和庆大霉素-两性霉素B双抗(100×)均不敏感.细胞结晶紫染色结果显示:细胞培养基中添加一定浓度的氯霉素(25 mg/L)、红霉素(200 mg/L)或四环素(2.5 mg/L)均可抑制细胞培养中"黑胶虫"的增殖,降低其对细胞增殖的抑制作用.综上所述,本研究分离鉴定的"黑胶虫"为一种短波单胞菌,低浓度的氯霉素、红霉素或四环素均可降低该菌对细胞增殖的抑制作用.鉴于研究的局限性,我们不排除"黑胶虫"是其他物种的可能性,但是本研究为"黑胶虫"的种属鉴定及细胞无菌化培养提供了新的研究思路及方法,并有望帮助一些实验室解决"黑胶虫"污染的困扰. 展开更多
关键词 细胞培养 污染 “黑胶虫” 纳米细菌 抗生素
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哈氏弧菌(Vibrio harveyi)recA基因的克隆与原核表达 被引量：3
4
作者 常云胜 周维 +1 位作者 高增鸿 丁燏 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期1947-1954,共8页
SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SO... SOS反应不仅能够促使细菌本身产生耐药性,而且与细菌耐药基因的水平转移密切相关。rec A是细菌SOS反应的重要基因,影响SOS反应的开启和关闭。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因rec A（recombinase A）,并对rec A基因进行了生物信息学分析。并构建了rec A基因的原核表达载体PGEX-rec A,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导表达,对Rec A蛋白的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,rec A基因的开放阅读框为693 bp,编码230个氨基酸,Rec A蛋白理论分子量为25.29 k D。重组蛋白表达的优化条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。 展开更多
关键词 哈氏弧菌 RECA 基因克隆 原核表达
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哈氏弧菌(Vibrio harveyi)lexA基因的克隆与原核表达 被引量：1
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作者 常云胜 周维 +1 位作者 高增鸿 丁燏 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期4315-4321,共7页
LexA是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexA,并对lexA基因进行了生物信息学分析;构建了lexA基因的原核表达载体... LexA是调节SOS反应的阻遏蛋白,而且与细菌耐药性的形成密切相关。本研究以水产养殖经济动物的条件致病菌哈氏弧菌ZJ0603基因组DNA为模板,设计同源引物克隆出SOS基因lexA,并对lexA基因进行了生物信息学分析;构建了lexA基因的原核表达载体PGEX-lexA,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达成功,还对LexA蛋白表达的诱导温度、时间、IPTG浓度等条件进行了优化。结果表明,lexA基因的开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸,LexA蛋白理论分子量为22.68 kD;重组蛋白表达的最优条件为37℃、0.04 mmol/L IPTG诱导6 h。 展开更多
关键词 哈氏弧菌 LEXA 基因克隆 原核表达
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