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抗B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的制备及活性研究
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作者 吉元刚 张国利 +12 位作者 李泽鸿 岳玉环 吴广谋 田园 刘雨玲 李玉洁 赵鑫 付玉和 王冬冬 张培培 侯天全 徐艳玲 马洪园 《中国兽药杂志》 北大核心 2016年第7期1-6,共6页
以克隆表达的B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)为抗原,从噬菌体抗体库Tomlinson I+J筛选出得到活性高和特异性高的全人源单链抗体(Sc Fv),结合能够携带外源蛋白有效通过生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制备跨膜单链抗体(TAT-Sc Fv)。经PCR后酶... 以克隆表达的B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)为抗原,从噬菌体抗体库Tomlinson I+J筛选出得到活性高和特异性高的全人源单链抗体(Sc Fv),结合能够携带外源蛋白有效通过生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制备跨膜单链抗体(TAT-Sc Fv)。经PCR后酶切,克隆到原核表达载体(p ET-28a-TAT)中,构建含有跨膜肽(TAT)的抗B型肉毒毒素胞内抗体融合蛋白,并在大肠杆菌中诱导表达,进行纯化工艺,对产物进行浓度纯度、亲和常数测定及生物活性研究。成功构建TAT-Sc Fv表达载体,融合蛋白相对分子量为32.7 k Da,主要以可溶形式表达,纯度也达到95%以上,胞内抗体中和B型肉毒毒素致病轻链得到TAT-Sc Fv的亲和常数为(1.133±0.273)×106L/mol,小鼠神经细胞乙酰胆碱定量测定实验证明胞内抗体具有较好的抗毒素活性。此结果为B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的研制和肉毒中毒治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 跨膜肽(TAT) 重组蛋白 表达 蛋白纯化 亲和常数 乙酰胆碱
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用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备
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作者 吉元刚 张国利 +12 位作者 李泽鸿 岳玉环 吴广谋 田园 刘雨玲 李玉洁 赵鑫 付玉和 王冬冬 张培培 侯天全 徐艳玲 马洪园 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第9期901-905,共5页
目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有... 目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。 展开更多
关键词 SNAP25-VAMP 绿色荧光蛋白 肉毒毒素活性 血清型
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