嵌合型口蹄疫病毒样颗粒组装研究 被引量：5

1

作者 董虎 郭慧琛 +4 位作者 敖大 韩世充 闫丹 刘湘涛 孙世琪 《安徽农业科学》 CAS 2014年第13期3902-3906,共5页

[目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础。[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源... [目的]为研究和制备多联或多价口蹄疫病毒样颗粒疫苗奠定基础。[方法]将FLAG序列通过融合PCR技术插入口蹄疫结构蛋白VP1GH-loop可变区,并通过大肠杆菌原核表达技术表达口蹄疫病毒衣壳蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1,在体外组装出嵌合FLAG外源多肽的口蹄疫病毒样颗粒。[结果]大肠杆菌表达的口蹄疫衣壳蛋白主要以可溶性存在,在缓冲体系中融合标签被切除衣壳蛋白VP0、VP3和FLAGVP1组装成病毒样颗粒,其大小约25 nm左右。FLAG序列成功插入GH-loop可变区第150-151氨基酸位点之间,外源多肽的插入没有影响衣壳蛋白VP1的空间结构。[结论]口蹄疫loop可变区引入外源抗原是可行的,但外源多肽的大小及理化性质会影响病毒样颗粒的组装效率。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 原核表达 GH-loop 嵌合型病毒样颗粒

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CD44受体分子对口蹄疫病毒感染的影响 被引量：4

2

作者 谷玲军 郭慧琛 +3 位作者 郜原 韩世充 孙世琪 杨玉莹 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1482-1488,共7页

为探索CD44分子在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,揭示FMDV的感染机制,为开发阻断FMDV入侵的药物和高效疫苗提供新靶点。采用Western-blot、TCID50检测、激光共聚焦显微镜检测等方法,检测FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达水平,以及用抑制剂... 为探索CD44分子在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,揭示FMDV的感染机制,为开发阻断FMDV入侵的药物和高效疫苗提供新靶点。采用Western-blot、TCID50检测、激光共聚焦显微镜检测等方法,检测FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达水平,以及用抑制剂MβCD抑制CD44表达后对FMDV增殖的影响。Western-blot结果显示,FMDV感染BHK21细胞后,CD44的表达量显著上升(P<0.05);用MβCD抑制内源性CD44表达后,FMDV的增殖水平显著降低(P<0.05)。TCID50检测结果显示,用MβCD抑制CD44表达后,FMDV的表达显著降低(P<0.05)。激光共聚焦结果显示,FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达量上升。表明,CD44分子参与FMDV的感染过程,可能作为调控分子直接或间接参与FMDV的入侵过程,仍需要进一步研究。 展开更多

关键词 CD44 口蹄疫病毒 感染 TCID50 WESTERN-BLOT 激光共聚焦显微镜检测

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非洲猪瘟病毒调控宿主天然免疫应答机制研究进展 被引量：5

3

作者 何文瑞 杨中元 +2 位作者 韩世充 万博 张改平 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 2022年第4期523-531,共9页

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度致死性猪传染病,目前尚无针对该病的有效疫苗和治疗手段。本综述着眼于宿主抗病毒天然免疫应答过程,重点阐述新近发现的ASFV编码蛋... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的高度致死性猪传染病,目前尚无针对该病的有效疫苗和治疗手段。本综述着眼于宿主抗病毒天然免疫应答过程,重点阐述新近发现的ASFV编码蛋白对干扰素(interferon,IFN)信号通路、炎症反应和细胞凋亡过程的调控作用,分析了相关病毒蛋白在ASFV感染、复制和致病力方面的影响,指出了潜在的ASFV新型疫苗研究靶点,以期为临床治疗药物和新型高效疫苗的研发提供方向和思路。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 天然免疫反应 干扰素信号通路 炎症反应 细胞凋亡

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非洲猪瘟病毒MGF110-5L-6L蛋白诱导宿主细胞翻译阻滞和应激颗粒形成的作用机制 被引量：1

4

作者 樊帅 钟函 +5 位作者 杨中元 何文瑞 万博 魏战勇 韩世充 张改平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1401-1416,共16页

【背景】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引发的一种猪烈性传染病,是全球公认的养猪业“头号杀手”,至今尚无安全有效的疫苗和药物。病毒作为专性细胞内寄生物,必须通过“劫持... 【背景】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引发的一种猪烈性传染病,是全球公认的养猪业“头号杀手”,至今尚无安全有效的疫苗和药物。病毒作为专性细胞内寄生物,必须通过“劫持”宿主翻译系统为病毒蛋白合成服务。其中翻译起始因子eIF2α作为翻译调控的核心节点,控制细胞应激反应和翻译重编程走向,对病毒毒力、嗜性、致病性及免疫逃逸等具有重要影响,eIF2α磷酸化调控无疑是病毒与宿主细胞竞争翻译资源的重要阵地之一。然而,关于ASFV编码蛋白与eIF2α磷酸化作用关系的认知极度匮乏。【目的】探究非洲猪瘟病毒MGF110-5L-6L蛋白对宿主细胞翻译阻滞和促进应激颗粒形成的作用机制,为深入揭示非洲猪瘟病毒的致病机制研究提供科学依据。【方法】在前期利用荧光素酶报告基因载体和绿色荧光报告载体,筛选发现外源表达MGF110-5L-6L极显著上调eIF2α磷酸化水平的基础上。选择猪肺泡巨噬细胞3D4/21和猪肾细胞PK-15作为研究用细胞系,利用质粒转染和特异性化学药物处理等方法,结合免疫印迹和激光共聚焦显微镜等检测技术,验证了MGF110-5L-6L蛋白与eIF2α磷酸化及其下游翻译效应之间的功能关系。随后,通过生物信息学网站预测、亚细胞定位和功能分析等,研究了MGF110-5L-6L蛋白与诱导细胞应激之间的相关性。【结果】证实外源表达ASFV多基因家族蛋白MGF110-5L-6L能够显著增强细胞内eIF2α磷酸化水平及激活转录因子ATF4表达量,诱导综合应激反应的发生;还可诱导细胞发生内质网应激和未折叠蛋白反应,并通过活化PERK和PKR激酶来诱发eIF2α的磷酸化,进而导致细胞蛋白翻译阻滞和应激颗粒形成。进一步证实,MGF110-5L-6L蛋白含有两个高度保守的半胱氨酸基序,且主要定位于内质网,少量分布于高尔基体、线粒体和溶酶体,还可� 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 MGF110-5L-6L蛋白 eIF2α磷酸化 翻译阻滞 应激颗粒

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基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

5

作者 史燕 李名洋 +6 位作者 樊帅 胡曼 张雨杭 何文瑞 万博 韩世充 张改平 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1398-1405,共8页

参考甲型塞内卡病毒(SVA)CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在I... 参考甲型塞内卡病毒(SVA)CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在IBRS-2细胞上进行转染和传代,以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017;经遗传稳定性评价后,利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验,鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示,重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2,即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株,且具有良好的遗传稳定性;拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明,通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统,可以在质粒水平快速编辑病毒基因组,为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。 展开更多

关键词 甲型塞内卡病毒 单质粒拯救系统 感染性克隆 反向遗传学 生物学特性

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核不均一核糖核蛋白K对塞内卡病毒IRES依赖性翻译及病毒复制影响的研究

6

作者 张璐 李露 +5 位作者 李名洋 樊帅 何文瑞 张雨杭 万博 韩世充 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1415-1423,共9页

基于前期塞内卡病毒(SVA)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的互作组学数据,本研究首先利用生物素标记RNA亲和捕捉技术和RNA免疫共沉淀试验,证实核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)与SVA基因组互作,且利用MTS试验证实... 基于前期塞内卡病毒(SVA)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的互作组学数据,本研究首先利用生物素标记RNA亲和捕捉技术和RNA免疫共沉淀试验,证实核不均一核糖核蛋白K(hnRNP K)与SVA基因组互作,且利用MTS试验证实敲降或过表达hnRNP K对细胞活性影响不显著。为深入探究hnRNP K在SVA复制过程中的功能,本研究利用Western-blot和TCID50试验检测hnRNP K蛋白对SVA病毒蛋白表达和病毒滴度的影响,结果显示,敲降hnRNP K显著降低病毒蛋白VP2的表达量及病毒滴度,而过表达hnRNP K则显著增加VP2表达量及病毒滴度。利用间接免疫荧光和核质分离试验观察病毒感染对hnRNP K亚细胞定位的影响,发现SVA感染可诱导hnRNP K由细胞核向细胞质移位。通过双荧光素酶报告基因试验检测hnRNP K对帽依赖性翻译和SVA IRES依赖性翻译活性的影响,结果表明,敲降和过表达hnRNP K蛋白均对帽依赖性翻译活性无显著影响,敲降hnRNP K显著降低SVA IRES依赖性翻译活性,而过表达hnRNP K则显著增强IRES翻译活性。综上所述,本研究证实hnRNP K是SVA的关键反式作用因子,正调控病毒IRES依赖性翻译及病毒复制,为深入了解小RNA病毒蛋白翻译和复制的分子机制提供了新的见解。 展开更多

关键词 核不均一核糖核蛋白K 塞内卡病毒 内部核糖体进入位点 核质移位

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大数据基础上的虚拟仿真教学与兽医实践教学研究

7

作者 何文瑞 张雨航 +2 位作者 韩世充 袁晋 万博 《中文科技期刊数据库（全文版）教育科学》 2023年第6期72-74,共3页

兽医实践教学是兽医学科高等教育中极其重要的环节之一,传统的教学方式已经不能满足理论与实践相结合的需求。近年来,随着大数据统计、云计算、分布式存储、AI预警体系等信息学技术的日趋成熟,虚拟仿真教学已在多个领域大规模应用推广... 兽医实践教学是兽医学科高等教育中极其重要的环节之一,传统的教学方式已经不能满足理论与实践相结合的需求。近年来,随着大数据统计、云计算、分布式存储、AI预警体系等信息学技术的日趋成熟,虚拟仿真教学已在多个领域大规模应用推广。兽医实践教学与虚拟仿真教学的结合将有效解决生产实践环节与理论教学的衔接困难,对兽医学科的快速发展及人类公共卫生健康的保障有重要战略意义。 展开更多

关键词 大数据 虚拟仿真教学 兽医实践教学

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表达H120 S基因膜外区段的重组鸡传染性支气管炎病毒的拯救 被引量：1

8

作者 魏衍全 郭慧琛 +3 位作者 王海明 孙德惠 韩世充 孙世琪 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期668-674,共7页

为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,... 为探索以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)Beaudette毒株为骨架表达H120纤突蛋白膜外区的可行性,本研究利用RT-PCR技术,扩增得到H120纤突基因膜外区段(1 302bp),将其置换到IBV Beaudette株全长cDNA克隆相应区段,构建了含有上述区段的重组IBV cDNA克隆BeauR-H120(S1)。然后直接将BeauR-H120(S1)作为DNA模板在体外转录出病毒基因组RNA,该转录产物电转入Vero细胞后48h收获细胞继续传代,直至第4代时出现合胞体,拯救获得一株重组IBV(rBeau-H120(S1))。通过RT-PCR方法证明rBeauH120(S1)基因组中包含有完整的H120纤突基因膜外区段。Western-blot试验证实rBeau-H120(S1)的N蛋白有表达,表明重组病毒在Vero细胞内进行了增殖。经连续传代后测定rBeau-H120(S1)的TCID50和EID50,结果显示,该重组病毒在Vero细胞中的滴度可达到105.90±0.22 TCID50/mL,在9日龄SPF鸡胚中生长滴度为106.13±0.23EID50/mL。免疫保护实验表明,在接种重组病毒21d时,鸡群抗体阳性率达到90%,使用强毒株M41(103 EID50/只)攻毒时免疫保护率为85%。本研究采用反向遗传操作技术构建的重组IBV,为进一步研制IBV重组基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 传染性支气管炎病毒 重组病毒 纤突蛋白膜外区 H120株

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A型塞尼卡病毒的分离鉴定及生物学特性研究 被引量：1

9

作者 郭笑然 韩世充 +3 位作者 张小丽 孙世琪 马小军 郭慧琛 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期555-563,共9页

本文报道了对分离自湖北地区的A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)CH-HB-2017毒株进行鉴定和生物学特性研究。全基因序列分析显示,该分离株与国内毒株CH-HN-2017、CH-HNSL-2017、CH-FJ-2017和美国毒株USA-IA44952-2015、USA-IA44662-2015... 本文报道了对分离自湖北地区的A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)CH-HB-2017毒株进行鉴定和生物学特性研究。全基因序列分析显示,该分离株与国内毒株CH-HN-2017、CH-HNSL-2017、CH-FJ-2017和美国毒株USA-IA44952-2015、USA-IA44662-2015和USA-SD41901-2015的同源性高。该SVA可在猪肾传代细胞(IBRS-2)和猪睾丸细胞(Swine testis cells,ST)中复制增殖,感染后都能产生CPE,通过病毒一步生长曲线、蚀斑试验和定量PCR等试验表明,该毒株对IBRS-2细胞更易感,病毒滴度更高。本实验成功分离到1株SVA流行毒株,并研究了该毒株的生物学特性,为深入研究该病毒奠定基础。 展开更多

关键词 A型塞尼卡病毒(SVA) 分离鉴定 生物学特性

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兽医专业学位研究生教育综合改革实践探索研究——以河南农业大学为例

10

作者 韩世充 何文瑞 +2 位作者 张雨杭 韩立强 万博 《中国科技经济新闻数据库 教育》 2022年第5期156-158,共3页

兽医专业学位是面向兽医行业,培养服务于动物疫病防控、动物源性食品安全和公共卫生安全等领域的专家型、管理型和复合型高层次应用人才。新形势下,兽医专业学位研究生培养出现了新的发展趋势。河南农业大学在依托兽医学科百余年沉淀的... 兽医专业学位是面向兽医行业,培养服务于动物疫病防控、动物源性食品安全和公共卫生安全等领域的专家型、管理型和复合型高层次应用人才。新形势下,兽医专业学位研究生培养出现了新的发展趋势。河南农业大学在依托兽医学科百余年沉淀的基础上,探索了一条适合区域性兽医专业技术人才培养的产学研协同发展新模式,为我国兽医专业研究生培养体制改革提供了新的思路。 展开更多

关键词 兽医专业 学位研究生 教育综合改革

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基于生物安全三级实验室的高致病性病原微生物检测虚拟仿真实验教学的构建 被引量：1

11

作者 韩世充 何文瑞 +2 位作者 张雨杭 褚贝贝 万博 《中文科技期刊数据库（全文版）教育科学》 2022年第9期170-173,共4页

新发突发传染病始终是全球安全的重大威胁。为树立学生的生物安全意识,强化学生的生物安全防护技能,构建了基于生物安全三级实验室模型的虚拟仿真实验。本项目采用虚实结合、沉浸体验、自主学习等教学方式,集聚以学生为中心、以问题为... 新发突发传染病始终是全球安全的重大威胁。为树立学生的生物安全意识,强化学生的生物安全防护技能,构建了基于生物安全三级实验室模型的虚拟仿真实验。本项目采用虚实结合、沉浸体验、自主学习等教学方式,集聚以学生为中心、以问题为导向的教学理念,设置多维度考核评价体系,不仅实现了学生在高等级生物安全实验室对高致病性病原微生物检测实验的全流程培训,还激发了学生学习兴趣,实现了实验教学质量和效率的全面提升。 展开更多

关键词 生物安全 生物检测 虚拟仿真实验教学

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非洲猪瘟病毒K205R蛋白的原核表达与单克隆抗体制备 被引量：1

12

作者 陈寅龙 郑南南 +6 位作者 吴宏举 侯浩宇 李潮 张昂克 韩世充 吴亚楠 杜永坤 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期1-7,共7页

为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R... 为研发非洲猪瘟病毒的免疫检测试剂提供素材,制备非洲猪瘟病毒K205R蛋白的单克隆抗体。采用PCR方法扩增K205R基因,构建重组表达质粒pET-30a-K205R,将重组质粒pET-30a-K205R转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中并通过IPTG诱导表达ASFV K205R蛋白。将纯化出的蛋白乳化后免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。将筛选出来的单克隆细胞注射至小鼠腹腔中,待小鼠腹部膨大时收集腹水,通过ELISA方法鉴定腹水效价、Western blot和IFA鉴定单克隆抗体特异性及反应原性,并对单克隆抗体亚型进行鉴定。经SDS-PAGE鉴定,重组ASFV K205R蛋白成功表达。Western blot分析显示,His标签抗体能够特异性识别重组表达的ASFV K205R蛋白,表明其具有良好的特异性以及反应原性。通过细胞融合和细胞筛选得到1株能稳定分泌抗ASFV K205R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1C3G6。ELISA检测腹水中抗体效价为1∶100000。Western blot和IFA鉴定结果显示单克隆抗体1C3G6与K205R蛋白反应性良好。通过亚型鉴定,单克隆抗体1C3G6的重链为IgG2b类,轻链为Kappa型。经Western blot和IFA鉴定,筛选得到的1C3G6单克隆抗体可以特异性识别原核系统和真核系统表达的K205R蛋白,说明该抗体具有良好的特异性。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 K205R蛋白 原核表达 单克隆抗体 Western blot鉴定

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