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hBPI与EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在MCF-7细胞中的表达和定位 被引量：2
1
作者 马海蓉 孙怡 +4 位作者 雷卫祺 陈双 马艳 赵民安 曹旭 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期876-879,共4页
目的:探讨人细菌透性增加蛋白(hBPI)在哺乳细胞中的表达和亚细胞定位。方法:以本人克隆得到的质粒pBE1为模板,利用一对带有Kozak序列以及删除终止密码子的引物进行PCR,获得的产物与pEGFP-N1载体连接,构建pBE2哺乳细胞特异表达载体并稳... 目的:探讨人细菌透性增加蛋白(hBPI)在哺乳细胞中的表达和亚细胞定位。方法:以本人克隆得到的质粒pBE1为模板,利用一对带有Kozak序列以及删除终止密码子的引物进行PCR,获得的产物与pEGFP-N1载体连接,构建pBE2哺乳细胞特异表达载体并稳定转染MCF-7细胞,获得了转基因细胞系。提取其基因组DNA,PCR扩增检查BPIcDNA片段和EGFP片段是否已整合入MCF-7细胞基因组中。提取总RNA,通过RT-PCR方法检查BPI-EGFP在转录水平的表达。Western blot进一步鉴定融合蛋白的表达定位。结果:荧光显微镜观察显示,BPI-EGFP融合蛋白分布在整个细胞质中,并且在核膜周围有高表达。PCR扩增证实了BPIcDNA片段和EGFP片段已整合入MCF-7细胞基因组中。RT-PCR证明了hBPI和EGFP的融合蛋白在MCF-7细胞中在转录水平的表达。Western blot分析显示hBPI-EGFP以定位于细胞质和分泌到MCF-7细胞外两种形式表达。结论:hBPI-EGFP融合蛋白与天然的嗜中性的多核粒细胞中的定位和转运特点是一致的。 展开更多
关键词 人细菌透性增加蛋白 融合蛋白 增强型的绿色荧光蛋白 MCF-7细胞
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利用GFP表达系统检测雌激素类化合物的研究 被引量：2
2
作者 雷卫祺 马海蓉 +1 位作者 孙怡 曹旭 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期24-29,共6页
根据雌激素类化合物的转录调节原理,构建受雌激素应答元件(ERE)调控的3×EREEGFP-N1重组报告基因载体,转染雌激素受体阳性的MCF-7乳腺癌细胞,分离出稳定转染的细胞克隆ERE-GFP-MCF7,将不同浓度的雌二醇(E2)及其他化合物加入稳定转... 根据雌激素类化合物的转录调节原理,构建受雌激素应答元件(ERE)调控的3×EREEGFP-N1重组报告基因载体,转染雌激素受体阳性的MCF-7乳腺癌细胞,分离出稳定转染的细胞克隆ERE-GFP-MCF7,将不同浓度的雌二醇(E2)及其他化合物加入稳定转染的细胞后检测GFP表达水平的变化。雌二醇(E2)以剂量依赖的方式诱导稳定转染细胞ERE-GFP-MCF7表达GFP,最大效应浓度为1×10-10mol/L,EC50为1.5×10-11mol/L;已知的植物雌激素大豆甙元和白藜芦醇同样以剂量依赖的方式诱导GFP的表达,EC50分别为2.4×10-7mol/L和6.2×10-6mol/L,而葡萄籽多酚没有明显的雌激素样活性。雌激素拮抗剂他莫西芬以剂量依赖的方式抑制雌二醇诱导GFP的表达,最大抑制浓度为1×10-7mol/L。利用此细胞模型检测不同化合物诱导的GFP表达强度可快速检测雌激素受体的配体。 展开更多
关键词 ERE 雌激素受体 EGFP 药物筛选
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人细菌透性增加蛋白cDNA的克隆及序列分析
3
作者 马海蓉 雷卫祺 +5 位作者 孙怡 赵民安 丁凌陆 陈双 曹旭 汪汉卿 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期92-94,共3页
从新疆维吾尔族健康人造血干细胞中提取总RNA,用反转录(reverse transcription,RT)和降落PCR (touchdown PCR,TD-PCR)相结合的方法扩增人细菌透性增加蛋白(human bactericidal/permeability-increasing protein,hBPI)的cDNA,将其克隆到p... 从新疆维吾尔族健康人造血干细胞中提取总RNA,用反转录(reverse transcription,RT)和降落PCR (touchdown PCR,TD-PCR)相结合的方法扩增人细菌透性增加蛋白(human bactericidal/permeability-increasing protein,hBPI)的cDNA,将其克隆到pEGFP-N1载体上并进行DNA序列测定。结果表明,所克隆的hBPIcDNA全长为1,464个碱基,其序列与GenBank中另外4个序列进行了比对,有两个碱基与其它4个序列不同:其中第576位碱基其它序列为G,该位置碱基是C;第676位碱基其它序列为A,该位置碱基是G。其中第676位碱基的变化导致第185位氨基酸由Lys改变为Glu。 展开更多
关键词 人细菌透性增加蛋白 CDNA TD—PCR 基因克隆 DNA序列分析
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