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山羊源伪结核棒状杆菌的分离鉴定及其毒力评价
1
作者 崔宁 党光辉 +4 位作者 鹿萍 郭若男 姜艳艳 陈凡若 刘思国 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第10期65-70,114,115,共8页
为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评... 为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评价。结果表明:共得到3株分离株,其菌落形态和生化特性菌与伪结核棒状杆菌相符,分别命名为CP045、CP073、CP969;分离株CP045、CP073、CP969的16S rDNA基因序列与伪结核棒状杆菌参考株的相似性分别高达98.8%、100%、99.8%,进一步确定3株分离株均为伪结核棒状杆菌。注射分离株CP073的3只小鼠中有2只于注射后36~48 h陆续死亡,1只精神极度沉郁、食欲不振;注射分离株CP045、CP969的3只小鼠于注射后5 d内均未见死亡,但状态不佳。注射分离株CP045、CP073、CP969的小鼠肝脏均不同程度出血、肿大,脾脏轻微出血;注射分离株CP073的小鼠皮肤表面有黄色脓汁渗出,皮下有黄白色玉米粒大小的结核样脓肿;注射分离株CP045和CP969的小鼠皮下未见明显脓肿。说明该山羊养殖场疑似患有伪结核病的病羊感染了伪结核棒状杆菌,分离到的3株伪结核棒状杆菌毒力不同,其中分离株CP073可引起小鼠死亡,毒力较分离株CP045、CP969强。 展开更多
关键词 伪结核棒状杆菌 伪结核病 分离 鉴定 16S rDNA 致病性试验 生化鉴定
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结核分枝杆菌PE26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖 被引量：2
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作者 陈凡若 党光辉 +5 位作者 张嘉俊 鹿萍 崔宁 崔莹莹 崔子寅 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期502-509,共8页
结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p... 结核分枝杆菌(MTB)PE/PPE家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究PE/PPE家族中PE26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-PE26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-PE26/Ms,经western blot鉴定结果显示,p AIN-PE26/Ms正确表达重组PE26蛋白(rPE26)。利用差速离心分离p AIN-PE26/Ms亚细胞组分,经western blot鉴定结果显示,r PE26定位于p AIN-PE26/Ms细胞壁。通过p AIN-PE26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定,结果显示,p AIN-PE26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙,脊不规则且相对较高,褶皱不明显;p AIN-PE26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞,通过q RT-PCR检测pe26转录水平,结果显示,H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-PE26/Ms感染巨噬细胞,分别通过q RT-PCR、ELISA检测细胞因子转录和表达水平,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、流式细胞术和胞内定殖的方法检测细胞毒性,结果显示,p AIN-PE26/Ms促进宿主细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的转录和表达(P<0.05);r PE26促进巨噬细胞死亡,且在感染48 h时促进细胞早期凋亡(P<0.05);r PE26促进p AIN-PE26/Ms在巨噬细胞内的定殖(P<0.01)。上述结果首次表明,定位于细胞壁的r PE26在感染巨噬细胞过程中促进p AIN-PE26/Ms的生长、炎性细胞因子的转录和表达、巨噬细胞凋亡和胞内定殖。本实验为解析PE26参与分枝杆菌的致病机制和MTB调节宿主免疫反应的机制提供一定参考依据。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 巨噬细胞 PE/PPE家族蛋白 PE26
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副结核分枝杆菌免疫原蛋白的筛选及免疫保护效果评价
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作者 陈凡若 张嘉俊 +5 位作者 鹿萍 崔宁 崔莹莹 崔子寅 党光辉 刘思国 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1204-1214,共11页
【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养... 【背景】副结核病(paratuberculosis,PTB)是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)主要引起反刍动物的一种慢性消耗性传染病。患病动物表现为肉芽肿性肠炎和肠道的功能失调、顽固性腹泻、渐进性消瘦、营养不良、贫血、嗜睡甚至死亡。PTB给畜牧业造成巨大的经济损失,并且严重威胁公共卫生安全。由于目前临床上对于PTB的检测和控制手段不够完善,现有的PTB疫苗保护效果不佳,并且干扰牛结核病的诊断,因此亟需研发免疫原性强、保护效果佳的疫苗以用于PTB的防控。【目的】通过筛选MAP免疫原蛋白,并对其免疫保护效果进行评价,为PTB的防控提供数据支持。【方法】根据MAP的p22、map1272c、map3531c、map3783、map3701c以及map3527这6个基因,分别构建5种重组质粒,在获得5种重组蛋白基础上,联合MONTANIDE ISA 61 VG佐剂皮下多点注射免疫小鼠,通过IFN-γELISPOT试验筛选出最佳免疫原;随后将最佳免疫原和已报道的66NC融合蛋白混合,经皮下多点注射免疫小鼠,在二免3周后用1×10^(8)CFU的MAP K-10菌株腹腔感染小鼠。通过IFN-γELISPOT试验,抗体监测和细胞因子检测,分析感染后小鼠的体重、肝脏病理学和组织病理学变化及其荷菌数差异,综合评价候选亚单位疫苗的免疫原性和免疫保护效果。【结果】以MAP p22、map1272c、map3531c、map3783以及map3701c为基础成功构建和表达了5种融合蛋白58F、62F、69F、46F和52F,其中免疫58F后产生的IFN-γ水平最高,是更具潜力的候选免疫原,且以融合蛋白组合66NC+58F诱导持久高滴度的IgG、IgM、IgG1和IgG2a水平,诱导特异性的IFN-γ、TNF-α和IL-17A的释放;在保护效果评价中,融合蛋白组合66NC+58F抵抗MAP感染造成的体重下降,显著减轻肝脏的病理损伤,降低MAP在肝脏中的定植。【结论】融合蛋白组合66NC+58F诱导小鼠产生Th1和Th17型免疫反应,对MAP感染有着一定免疫� 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 亚单位疫苗 58F蛋白 免疫评价
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副结核分枝杆菌PanCD基因缺失株的构建及毒力评价
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作者 姜艳艳 鹿萍 +4 位作者 崔宁 陈凡若 崔莹莹 党光辉 刘思国 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2024年第7期36-42,共7页
为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium sme... 为了开发出能有效防控副结核病的减毒疫苗,试验采用同源重组的方法构建MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株,以MAP K-10菌株基因组为模板,扩增PanCD基因的上下游同源臂,构建pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,转化入耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)感受态细胞中获得噬菌体,并感染MAP K-10菌株,然后挑取单克隆扩大培养,提取基因组进行PCR鉴定;绘制MAP K-10菌株与MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长曲线;用MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠并评价其毒力,解剖取肝脏和脾脏,分析组织荷菌量和肝脏病理变化。结果表明:成功扩增出PanCD基因的上下游同源臂,经PCR扩增和酶切鉴定成功构建出pHAE159-p0004s-PanCD重组质粒,将重组质粒电转化入Msg感受态细胞中获得噬菌体,感染MAP K-10菌株后成功构建出MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株;与MAP K-10菌株相比,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株的生长速率明显下降;攻菌2周时,MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株感染小鼠的肝脏和脾脏中荷菌量显著减少;小鼠肝脏病变明显减轻。说明PanCD基因是MAP的一个重要毒力因子,构建的MAP K-10ΔPanCD基因缺失菌株可作为MAP减毒活疫苗的候选菌株。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 PanCD基因 基因缺失株 毒力评价 减毒活疫苗
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副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究 被引量：1
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作者 王建国 陈凡若 +10 位作者 鹿萍 臧鑫鑫 党光辉 姜艳艳 崔宁 冯婷婷 张嘉俊 王慧 崔莹莹 崔子寅 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期331-338,共8页
本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶... 本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 GDSL脂肪酶 MAP_2739 酶学特性
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