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CRISPR/Cas9技术介导Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建及其三维视网膜类器官培养 被引量：1
1
作者 杜雨馨 刘依宗 +1 位作者 阎飞跃 沈吟 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期388-397,共10页
目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素... 目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后,将打靶载体电转H9细胞系,在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2,进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序,根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系,通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例,采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官,于分化后不同时间点行冰冻切片,免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA,最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆,其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%,所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确,正常表达干细胞标志物,核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d,出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞,分化后45 d,出现RECOVERIN阳性光感受器细胞,分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层,水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层,光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESC 展开更多
关键词 视网膜类器官 3D培养 胚胎干细胞 光感受器前体细胞
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