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牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立 被引量：21
1
作者 闻晓波 崔玉东 +1 位作者 朱战波 朴范泽 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期322-324,共3页
通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigentic E.coli,ETEC)的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg2+、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,在优化条件的基础上,确... 通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigentic E.coli,ETEC)的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg2+、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,在优化条件的基础上,确定多重PCR的特异性和灵敏性,以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测,结果2株为F41、K99和STa阳性,4株为F41、STa阳性,1株为K99、STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明,该方法特异性强、敏感性高、简便、快速,适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。 展开更多
关键词 产肠毒素大肠杆菌 多重PCR K99菌毛 F41菌毛 STa
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大肠杆菌病病原学检测方法的研究进展 被引量：16
2
作者 冉旭华 王密 +1 位作者 闻晓波 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2008年第2期51-54,共4页
大肠杆菌主要寄居于人和动物的肠道内,在自然界分布广泛,属于条件致病菌。大肠杆菌能通过消化道使人类和畜禽发生感染和中毒。对大肠杆菌病的防治和流行病学调查都依赖于对病原的及时准确的检测和鉴定。本文对大肠杆菌病各种实验室病原... 大肠杆菌主要寄居于人和动物的肠道内,在自然界分布广泛,属于条件致病菌。大肠杆菌能通过消化道使人类和畜禽发生感染和中毒。对大肠杆菌病的防治和流行病学调查都依赖于对病原的及时准确的检测和鉴定。本文对大肠杆菌病各种实验室病原检测方法,包括细菌的分离培养、荧光免疫测定技术、免疫胶体金标记技术、免疫磁珠分离法、多重PCR、荧光定量PCR等方法作以概要性综述。 展开更多
关键词 大肠杆菌病 病原学检测 酶联免疫吸附分析法 多重PCR
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G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定 被引量：17
3
作者 闻晓波 张玲玲 +3 位作者 倪宏波 刘阳阳 曹思 冉旭华 《黑龙江八一农垦大学学报》 2016年第4期36-40,共5页
轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出... 轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出现CPE,至7代后细胞CPE现象明显,获得1株牛轮状病毒,扩增VP7、VP4基因并测序分析,结果表明该分离株属于G6P[5]型轮状病毒,命名为NX28。研究明确了G6P[5]型在国内牛群中的存在及流行,并为下一步的牛轮状病毒的分子流行病学研究奠定基础。 展开更多
关键词 牛 轮状病毒 基因型 G基因型 P基因型
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防御素研究进展 被引量：10
4
作者 闻晓波 崔玉东 《国外医学（免疫学分册）》 2002年第6期297-300,共4页
防御素是最近在动植物体内发现的一类阳离子抗菌肽 ,具有广谱的抗菌、抗病毒活性和非特异的细胞毒性作用 ,是先天性免疫系统的重要组成部分 ,而且把先天性免疫系统和获得性免疫系统联系起来。本文主要针对防御素的分布、基因定位、表达。
关键词 研究进展 防御素 先天性免疫 生物学作用 作用机制
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新城疫病毒F_(48)E_9株M NP F和HN基因的真核表达 被引量：11
5
作者 闻晓波 闫丽辉 +3 位作者 曹殿军 刘培欣 刘春国 步志高 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期429-433,共5页
将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单... 将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。 展开更多
关键词 新城疫病毒 M基因 NP基因 F基因 HN基因 真核细胞表达 病毒样颗粒
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产肠毒素性大肠杆菌致病因子F_(41)、K_(99)菌毛基因的克隆与表达 被引量：7
6
作者 闻晓波 崔玉东 +3 位作者 冉旭华 朱战波 朴范泽 潘兴广 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期797-800,共4页
目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化... 目的为了分析原核表达的ETECF41和K99菌毛亚单位的抗原性和作为基因工程亚单位疫苗的可能性。方法针对黏附素F41和K99的编码序列,设计两对特异性引物,扩增F41和K99菌毛蛋白的编码基因,经序列测定后,克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选到可以表达F41和K99菌毛亚单位的菌株。经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot试验分析原核表达的F41和K99重组蛋白的抗原性。结果表达的F41和K99菌毛亚单位蛋白可以与抗F41和K99菌毛蛋白的单因子血清反应。结论原核表达的F41和K99重组蛋白具有良好的抗原性。 展开更多
关键词 产肠毒素性大肠杆菌 F41菌毛 K99菌毛 原核表达
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新城疫病毒F48E9株M和NP基因的原核表达 被引量：6
7
作者 闻晓波 吴芬芳 +4 位作者 闫丽辉 曹殿军 刘培欣 刘春国 孔宪刚 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期181-185,共5页
根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAG... 根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因。经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,转化E.coliBL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在E.coliBL21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达。用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。 展开更多
关键词 新城疫病毒 M基因 NP基因 原核表达
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《兽医免疫学》教学中的理论与实践相结合 被引量：7
8
作者 冉旭华 闻晓波 +1 位作者 王新 邵红 《畜牧与饲料科学》 2010年第9期76-77,共2页
《兽医免疫学》作为兽医专业的基础课,其理论课学习难度较大且与实践结合紧密。因此,在教学过程中,应根据教学的需要对教学方式进行改革,以加强与其他学科之间的渗透,尤其是与兽医临床应用的紧密结合。阐述了与实践结合紧密的教学方案... 《兽医免疫学》作为兽医专业的基础课,其理论课学习难度较大且与实践结合紧密。因此,在教学过程中,应根据教学的需要对教学方式进行改革,以加强与其他学科之间的渗透,尤其是与兽医临床应用的紧密结合。阐述了与实践结合紧密的教学方案、改善实验教学方法、充分利用现代化教学工具、改革考试方式等方面的教学改革措施,以达到提高学生学习积极性,在掌握扎实理论基础知识的同时也具备良好的实践操作能力,以及有效提高教学质量的目的。 展开更多
关键词 兽医免疫学 教学 实践
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动物医学本科生实践创新能力培养模式的建立 被引量：6
9
作者 冉旭华 倪宏波 +2 位作者 计红 王春仁 闻晓波 《畜牧与饲料科学》 2016年第2期67-69,共3页
以黑龙江省教育科学规划重点课题"动物医学本科生实践能力和创新能力培养的策略研究"为平台,以培养勇于创新、具有卓越实践能力的动物医学本科生为目标,以促进动物医学专业本科生教育与现代畜牧业发展紧密结合为出发点,在黑... 以黑龙江省教育科学规划重点课题"动物医学本科生实践能力和创新能力培养的策略研究"为平台,以培养勇于创新、具有卓越实践能力的动物医学本科生为目标,以促进动物医学专业本科生教育与现代畜牧业发展紧密结合为出发点,在黑龙江八一农垦大学动物医学本科生培养过程中,分析了影响实践教学质量的因素,提出了解决办法,建立了动物医学本科生实践创新能力培养模式,从而提高本科生的实践能力,使其更好地适应现代畜牧业对兽医人才的需求。 展开更多
关键词 动物医学 人才培养 实践创新 本科生
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C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定 被引量：6
10
作者 冉旭华 张峣 +6 位作者 曹思 卢元赫 张玲玲 刘阳阳 倪宏波 朱战波 闻晓波 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第5期1368-1373,共6页
为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将... 为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1 056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。 展开更多
关键词 牛副流感3型病毒 C基因型 分离 鉴定 同源性比对
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牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：6
11
作者 毕莹 闻晓波 倪宏波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第10期1050-1054,共5页
目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导... 目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛传染性鼻气管炎病毒 gD蛋白 单克隆抗体
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牛副流感病毒3型研究概述 被引量：6
12
作者 冉旭华 张峣 闻晓波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2017年第3期24-28,共5页
牛副流感病毒3型(BPIV3)是引起牛呼吸系统疾病的主要病原,广泛分布于世界养牛业发达地区,BPIV3常与其他病毒或细菌混和感染或继发感染,对养牛业造成巨大的经济损失。此文从BPIV3的分子结构、致病机制、免疫逃避、种间传播、病毒病诊断... 牛副流感病毒3型(BPIV3)是引起牛呼吸系统疾病的主要病原,广泛分布于世界养牛业发达地区,BPIV3常与其他病毒或细菌混和感染或继发感染,对养牛业造成巨大的经济损失。此文从BPIV3的分子结构、致病机制、免疫逃避、种间传播、病毒病诊断与防控等方面介绍BPIV3的研究概况,为该病毒的基础研究及相关疾病的防控提供参考。 展开更多
关键词 牛副流感病毒3型 免疫逃避 种间传播 诊断 防控
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新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达 被引量：6
13
作者 冉旭华 闻晓波 +1 位作者 赵喜红 刘长凤 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第3期11-13,共3页
目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的F基因和HN基因。方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到... 目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的F基因和HN基因。方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到原核表达载pET30a上,得到重组质粒rpET30a-NDV/F和rpET30a-NDV/HN,转化到受体菌Rosetta-gamiTM2感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测。结果:表达的F蛋白大小约为40kD,HN蛋白大小约为51kD左右,符合预期结果。Western blot分析表明,能与抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应。结论:重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达。说明了去除F和HN基因N端信号肽和C端跨膜区的必要性。 展开更多
关键词 新城疫病毒(NDV) F蛋白 HN蛋白 原核表达
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新城疫病毒样颗粒(ND-VLPs)免疫效力的研究 被引量：6
14
作者 吴芬芳 闫丽辉 +3 位作者 曹殿军 刘培欣 闻晓波 孔宪刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期42-46,63,共6页
为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化。2周后用相同剂... 为了研究ND-VLPs的免疫原性,利用共表达NDV F、HN、NP和M蛋白的重组杆状病毒rBac-F-HN-NP-M感染Sf9细胞,采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的VLPs,免疫60只,18日龄SPF鸡,监测血清中NDV特异性抗体滴度的变化。2周后用相同剂量的VLPs加强免疫。二免后2周以3.16×103EID50的F48E9株强毒滴鼻攻毒。攻毒前,LaSota灭活苗、LaSota+20μgVLP和不同剂量VLPs组(10μg、20μg、25μg)HI效价分别为28.3、28.9、24.1、26.1、26.7;攻毒后,10μg和20μgVLP免疫组仅能提供了80%和90%的保护率,但与LaSota灭活苗、LaSota+20μgVLP一样,25μgVLP试验组却能够完全抵抗致死剂量的NDV强毒攻击。本试验表明,ND-VLPs具有良好的免疫原性,25μgVLP诱导机体产生的免疫应答能抵抗致死剂量强毒的攻击。ND-VLPs有可能用来研制针对新城疫流行变异株的高效疫苗。 展开更多
关键词 新城疫病毒 病毒样颗粒 免疫原性 免疫效力
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检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立 被引量：4
15
作者 冉旭华 赵喜红 +3 位作者 闻晓波 倪宏波 李树东 周恩民 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期544-547,556,共5页
用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为... 用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为98.8%。Western blot检测结果58份阳性,两者的符合率为96.9%。试验结果表明,本试验所建立的间接阻断ELISA方法具有良好敏感性和特异性,可用于PRRS流行病学调查和疾病的诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 重组N蛋白 间接阻断ELISA 流行病学调查
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关于研究生课程教学改革的思考 被引量：3
16
作者 冉旭华 闻晓波 《科技风》 2023年第17期61-63,共3页
课程教学是研究生培养的核心环节之一,是决定研究生培养质量的关键因素。为培养出符合当代社会需求的高素质研究生,近些年来研究生的教学目标、教学内容、教学模式等一直在进行着不断的调整和完善。研究生课程教学改革面临着新的挑战。... 课程教学是研究生培养的核心环节之一,是决定研究生培养质量的关键因素。为培养出符合当代社会需求的高素质研究生,近些年来研究生的教学目标、教学内容、教学模式等一直在进行着不断的调整和完善。研究生课程教学改革面临着新的挑战。本文深入探讨了目前研究生课程教学中存在的一些主要问题,分析其产生的原因及弊端。并从课程内容选择、常见教学模式、考核方式、课程管理等方面总结比较,探讨研究生课程改革的模式,提出意见和建议,以供研究生教学和管理人员参考。 展开更多
关键词 课程教学改革 教学模式 研究生课程教学
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猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析 被引量：5
17
作者 闻晓波 李冬野 +8 位作者 李树东 冉旭华 李晓娟 邵磊 王密 朴范泽 杨焕民 侯喜林 倪宏波 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第2期41-44,共4页
为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原... 为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 ORF2 ORF1 表达
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猪轮状病毒Gottfried株和SB-1A株截短VP8基因的原核表达、蛋白纯化及免疫原性分析 被引量：5
18
作者 魏晓曼 闻晓波 +1 位作者 冉旭华 崔玉东 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2013年第8期1049-1053,共5页
目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*... 目的原核表达猪轮状病毒(porcine rotavirus,PRV)Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化重组蛋白,并检测其免疫原性。方法经PCR从含有全长VP4基因片段的重组质粒pCR4-Gottfried VP4和pCR4-SB-1A VP4中分别扩增截短的VP8*基因(△VP8*,64～223位氨基酸),分别插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a-Gottfried-△VP8*和pET-28a-SB-1A-△VP8*,分别转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。应用ProBondTMResin纯化两种重组蛋白,重组蛋白与A(lOH)3佐剂混合后,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的血清抗体水平。结果两种重组表达质粒经双酶切和测序证实构建正确;表达的两种目的蛋白相对分子质量约25 000,均以包涵体和可溶性两种形式存在,均可与鼠源抗Histag单克隆抗体特异性结合;纯化的两种重组蛋白纯度均在95%以上,免疫BALB/c小鼠可产生较高的血清抗体水平。结论成功在大肠埃希菌中表达了PRV Gottfried株和SB-1A株截短的VP8*基因,纯化的两种蛋白免疫原性较好,为进一步研制安全、高效的PRV亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 截短VP8＊基因 原核细胞 基因表达 纯化 免疫原性
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新城疫病毒F、NP、M和HN基因在昆虫细胞内的共表达 被引量：5
19
作者 闻晓波 闫丽辉 +2 位作者 曹殿军 刘培欣 刘春国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期257-262,共6页
为构建杆状病毒转移载体,通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的Stu I位点和NP基因上的Xba I位点进行突变,扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病... 为构建杆状病毒转移载体,通过PCR的方法将F48E9株新城疫病毒F基因上的Stu I位点和NP基因上的Xba I位点进行突变,扩增出全长的F、NP以及F48E9株新城疫病毒M和HN基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,再将F、NP、M和HN基因依次亚克隆到杆状病毒转移载体pAcAB_4上,F基因和M基因均在p10启动子的操控之下,NP基因和HN基因构建到两个polyhedrin启动子下游,构建重组杆状病毒转移载体pAcAB4_4-F-NP-M-HN。pAcAB_4-F-NP-M-HN与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-F-NP-M-HN。重组杆状病毒感染Sf9细胞,72h后收集细胞和培养上清。Western blot分析显示:M、NP、F和HN蛋白在培养上清中得到了共表达,大小与预期结果一致;感染细胞内只检测到了HN蛋白的表达。这表明M、NP、F和HN蛋白在昆虫细胞内共表达可以自我装配成病毒样颗粒,并且以出芽的方式释放到培养基中。该重组杆状病毒的获得为研究新城疫病毒各结构蛋白之间的相互作用和确定病毒粒子出芽的驱动力等方面奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 杆状病毒 转移载体 表达
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肝片形吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶对SD大鼠的免疫原性分析 被引量：5
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作者 闻晓波 冉旭华 +5 位作者 王春仁 宋佰芬 魏晓曼 李晓娟 王密 苗艳 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期46-48,53,共4页
目的分析肝片形吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶(FhGST)对SD大鼠的免疫原性。方法将已构建重组原核表达质粒pET30a-FhGST转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌,以异丙基-β-D-硫代半乳精苷(IPTG)诱导重组蛋白表达十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳... 目的分析肝片形吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶(FhGST)对SD大鼠的免疫原性。方法将已构建重组原核表达质粒pET30a-FhGST转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌,以异丙基-β-D-硫代半乳精苷(IPTG)诱导重组蛋白表达十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫反应性。20只SD大鼠随机均分为蛋白免疫组和佐剂对照组,蛋白免疫组以纯化的重组蛋白皮下注射免疫Sd大鼠,抗原免疫剂量为200μg/(只·次),共免疫3次,每次间隔3周。佐剂对照组以PBS代替免疫抗原同法注射。免疫前、每次免疫后和末次免疫后3周、6周鼠尾采血,分离血清。利用间接ELISA法检测免疫大鼠血清IgG抗体水平的动态变化,噻唑兰法(MTT法)检测脾淋巴细胞增殖情况。结果经纯化获得重组FhGST蛋白,SDS-PAGE电泳结果显示,在相对分子质量M_r 31300处出现单一条带。Western blotting分析结果表明,纯化重组FhGST蛋白能识别自然感然肝片形吸虫的山羊阳性血清,在M_r 31 300处可见特异的免疫反应带。重组FhGST蛋白免疫SD大鼠后,可诱导产生特异性IgG抗体,在免疫后第9周,抗体效价达到顶峰(1:89 144),且明显高于佐剂对照组(1:1000)重组蛋白能显著刺激大鼠脾细胞的生长和增殖。结论重组FhGST蛋白能诱导SD大鼠产生特异性免疫应答,具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 肝片形吸虫 谷胱甘肽-S 转移酶 SD大鼠 免疫原性
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