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弓形虫ROP18蛋白激酶在酵母中的表达纯化及激酶活性鉴定 被引量：1
1
作者 侯永恒 郝桃方 +4 位作者 廖婉琴 杨兆收 潘爱华 吴忠道 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2016年第6期687-690,共4页
目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP1... 目的建立利用酵母表达系统获得有较高激酶活性的弓形虫棒状体蛋白（ROP18）激酶的表达纯化方法。方法利用PCR技术从弓形虫基因组DNA扩增弓形虫ROP18基因,通过Gateway系统将ROP18基因克隆到酵母表达载体pEGH-A中。将表达载体pEGH-A-ROP18转化至Y258酵母菌株中并诱导表达,表达产物纯化后通过SDS-PAGE进行纯度鉴定;最后通过激酶活性实验对纯化的重组蛋白进行激酶活性鉴定。结果构建了弓形虫ROP18激酶重组表达质粒pEGH-A-ROP18和pEGH-A-ROP18-KD,并成功在酵母表达系统表达弓形虫ROP18重组蛋白,其分子量约为8.2×10 4 Mr,SDS-PAGE蛋白电泳显示为单一条带,并具有较高的激酶活性。结论利用酵母细胞表达系统成功表达并纯化了有激酶活性的弓形虫ROP18蛋白激酶。 展开更多
关键词 弓形虫 ROP18 酵母表达 纯化 激酶活性
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荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫株的构建及验证 被引量：1
2
作者 郝桃方 李文洁 +2 位作者 杨子帆 杨兆收 周兴旺 《热带医学杂志》 CAS 2017年第8期991-995,F0003,共6页
目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达R... 目的构建及验证荧光素酶标记ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,为研究弓形虫毒力及相关宿主免疫调控机制奠定良好基础。方法利用PCR技术扩增出目的片段ROP18-Ty1和带ROP18-Ty1同源序列接头的质粒骨架,通过重组克隆系统构建既能表达ROP18-Ty1又含荧光素酶标记的质粒P-ROP18-Ty1-LUC。将质粒PROP18-Ty1-LUC和筛选质粒P-TUB-CAT-SAG1通过电转染的方法转染到RH株弓形虫,经过氯霉素筛选和极限稀释得到目的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株。构建成功的弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株在基因、蛋白、动物水平进行验证。结果利用重组克隆系统成功构建了质粒P-ROP18-Ty1-LUC,利用双酶切实验和测序验证了序列的正确性。以弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株基因组为模板,用特异引物能PCR扩增出1 704 bp大小的ROP18-Ty1和1 644 bp大小的LUC基因;用特异抗体anti-Ty1通过Western blot检测外源蛋白ROP18-Ty1的表达,在56 000 Mr处有单一条带;用荧光素酶报告基因检测系统检测LUC的表达,利用多标记酶标仪检测到荧光的发射;通过活体成像系统检测ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株在小鼠体内的增殖,与对照组相比感染了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫株的小鼠体内photon值明显更多(P<0.05);最后小鼠毒力实验也验证了ROP18-Ty1-LUC RH弓形虫毒力比RH-LUC弓形虫的毒力强(P<0.05)。结论成功构建和验证荧光素酶标记的ROP18过表达弓形虫ROP18-Ty1-LUC RH株,可以在动物个体水平更客观统计ROP18对弓形虫增殖速率的影响。 展开更多
关键词 弓形虫 ROP18 荧光素酶 毒力
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