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微小染色体维持蛋白2基因诱导性敲除宫颈癌HeLa细胞系的建立及对DNA复制的影响
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作者 李萍 汤拓 +4 位作者 张鲁平 王涛 洪鲜 邓志会 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2024年第2期133-139,共7页
目的利用诱导性CRISPR/Cas9技术建立微小染色体维持蛋白2(MCM2)基因敲除的宫颈癌HeLa细胞系,并探究MCM2对DNA复制及复制压力的影响。方法使用诱导性CRISPR/Cas9系统TLCV2,构建MCM2敲除HeLa细胞系;并分为对照组(Control)、敲除1组(KO1)... 目的利用诱导性CRISPR/Cas9技术建立微小染色体维持蛋白2(MCM2)基因敲除的宫颈癌HeLa细胞系,并探究MCM2对DNA复制及复制压力的影响。方法使用诱导性CRISPR/Cas9系统TLCV2,构建MCM2敲除HeLa细胞系;并分为对照组(Control)、敲除1组(KO1)和敲除2组(KO2)。通过Western blot、EdU掺入实验、实时定量PCR、免疫荧光、CCK-8等实验,分析MCM2敲除对DNA复制和羟基脲诱导复制压力的影响。结果经过诱导后CRISPR/Cas9系统有效地敲除MCM2基因,并影响MCM2-7复合物的稳定。与对照细胞相比,MCM2敲除细胞DNA复制能力显著下降,同时Cyclin A1、Cyclin E1和CDK4的mRNA表达水平降低。在DNA复制压力下,MCM2敲除降低了细胞的存活能力、DNA损伤修复能力,并增加基因组的不稳定性。结论MCM2基因敲除降低正常条件下HeLa细胞的DNA复制能力,并降低复制压力后细胞的存活能力。本研究成功地构建了诱导性MCM2基因敲除HeLa细胞系,为进一步研究MCM2基因在宫颈癌中的作用及其生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 微小染色体维持蛋白2 基因敲除 宫颈癌 HELA细胞 DNA复制
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人WASH468和WASH465蛋白质特性辨析
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作者 张鲁平 +4 位作者 汤拓 李萍 洪鲜 邓志会 王涛 《医学分子生物学杂志》 CAS 2024年第2期93-99,共7页
目的探讨两种较为公认但序列不同的Wiskott-Aldrich综合征蛋白和富含脯氨酸同源物(Wiskott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog,WASH)的差异。方法使用免疫荧光、免疫共沉淀和激光微辐射等实验分析两种WASH在定位模式、与FAM21... 目的探讨两种较为公认但序列不同的Wiskott-Aldrich综合征蛋白和富含脯氨酸同源物(Wiskott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog,WASH)的差异。方法使用免疫荧光、免疫共沉淀和激光微辐射等实验分析两种WASH在定位模式、与FAM21或Ku蛋白的相互作用、向DNA损伤位点募集速率和蛋白质稳定性方面的差异;比较多种生物中的WASH蛋白质序列和检测多种在生物和医学研究中常用的细胞中的WASH编码序列,分析两种人WASH序列的普遍性和保守性。结果两种WASH展现出类似的内体(endosome)定位模式。WASH468表现出与FAM21更强的相互作用,并且WASH468展现出更强的稳定性。WASH465表现出与Ku蛋白更强的相互作用,并且WASH465展现出向DNA损伤位点更强的募集。多种生物中的WASH序列与人WASH468序列的一致性明显高于WASH465,并且多种在生物和医学研究中常用的细胞中的WASH氨基酸序列均与WASH468一致。结论WASH468和WASH465的生物学特性存在差异,WASH468序列的普遍性和保守性明显高于WASH465,因此WASH468是更保守的人WASH序列。 展开更多
关键词 Wiskott-Aldrich综合征蛋白和富含脯氨酸同源物 蛋白序列 保守性 相互作用 DNA修复
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