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小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备 被引量：5
1
作者 闫飞虎 王化磊 +9 位作者 邱泊宁 赵梓淇 李岭 赵永坤 王铁成 黄耕 高玉伟 冯娜 杨松涛 夏咸柱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第6期576-581,共6页
目的对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其... 目的对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)弱毒疫苗株血凝素蛋白(H)主要抗原表位区进行克隆及原核表达,并制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体。方法根据Gen Bank中登录的PPRV弱毒疫苗株H基因序列设计引物,RT-PCR扩增其主要抗原表位区域(去掉信号肽及跨膜区);将扩增产物克隆至表达载体p ET-30a(+)后,转化E.coli Transetta(DE3),经IPTG 37℃诱导表达目的蛋白;表达的目的蛋白经带His标签的镍离子蛋白纯化柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定;将纯化的H蛋白与弗氏佐剂混合乳化后免疫昆明鼠,3次免疫2周后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV H蛋白多克隆抗体,采用间接免疫荧光试验进行鉴定。结果质粒p ET-30a(+)-H经双酶切鉴定证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约60 000,能同时被抗His标签抗体和PPRV阳性绵羊血清识别,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的48%,纯度可达90%以上;制备的多克隆抗体能够识别PPRV全病毒抗原以及杆状病毒表达的重组PPRV H蛋白。结论成功构建了质粒p ET-30a(+)-H,并表达了PPRV H蛋白,制备的鼠源多克隆抗体为建立针对PPRV H蛋白的ELISA抗体检测方法及研制新型亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 H蛋白 原核表达 多克隆抗体
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层析技术制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒F(ab’)_2 被引量：2
2
作者 邱泊宁 王翀 +8 位作者 赵永坤 胡星星 王化磊 曹增国 盖微微 崔健男 闫飞虎 杨松涛 夏咸柱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第4期417-423,428,共8页
目的采用层析技术制备高纯度的马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrom coronavirus,MERS-CoV)F(ab’)_2。方法以MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,采用... 目的采用层析技术制备高纯度的马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrom coronavirus,MERS-CoV)F(ab’)_2。方法以MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,采用亲和层析技术提取血清IgG,经胃蛋白酶酶切后,通过阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分别对F(ab’)_2进行纯化;以MERS假病毒检测所制备的IgG与F(ab’)_2中和活性。结果凝胶过滤层析实现了F(ab’)_2的高纯度分离,最终制备的F(ab’)_2收率约70%,纯度为93%以上,具有良好的中和活性,其半数抑制浓度(IC_(50))为5.13μg/ml。结论制备了高纯度马抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2,为人用抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2生产工艺的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征 冠状病毒 病毒样颗粒 层析 免疫球蛋白
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MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定 被引量：2
3
作者 胡星星 邱泊宁 +11 位作者 迟航 王化磊 王翀 盖微微 金宏丽 黄培 冯娜 王铁成 高玉伟 赵永坤 杨松涛 夏咸柱 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2018年第4期336-340,共5页
目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒B... 目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。 展开更多
关键词 MERS-CoV S1蛋白 表达 纯化 鉴定
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马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab’)_2的制备 被引量：1
4
作者 邱泊宁 胡星星 +8 位作者 闫飞虎 王翀 崔健男 盖微微 曹增国 王化磊 赵永坤 杨松涛 夏咸柱 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期173-180,共8页
目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的... 目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab’)_2。间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率。结果所制备的特异性IgG与特异性F(ab’)2的纯度分别为90. 1%和92. 8%,收率分别为8. 7%和3. 07%;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab’)_2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总Ig G或总F(ab’)_2。结论成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab’)_2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2制备工艺奠定了基础。 展开更多
关键词 中东呼吸综合征 冠状病毒 病毒样颗粒 免疫亲和层析 免疫球蛋白 F(ab’)2
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小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性 被引量：1
5
作者 闫飞虎 赵梓淇 +9 位作者 王化磊 赵永坤 邱泊宁 王建忠 王铁成 黄耕 高玉伟 冯娜 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1225-1233,共9页
为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac^(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac^(TM) Dual-2M、pFastBac^(TM) Dual... 为了构建具有天然构象的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒,本试验扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,并分别克隆至双启动子载体pFastBac^(TM) Dual中,构建含有双目的基因的重组供体质粒pFastBac^(TM) Dual-2M、pFastBac^(TM) Dual-2F和pFastBac^(TM) Dual-2H;测序正确后转化至DH10Bac^(TM) 感受态细胞,同源重组获得穿梭质粒rBacmid-2M、rBacmid-2F和rBacmid-2H;将其分别转染昆虫细胞Sf9获得重组杆状病毒rpFB-2M、rpFB-2F和rpFB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38 000,59 000,68 000左右的条带,表明基质膜蛋白与2种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。本试验为后续小反刍兽疫病毒(PPRV)病毒样颗粒疫苗的进一步研发奠定了基础。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 基质膜蛋白 血凝素蛋白 融合蛋白 杆状病毒-昆虫细胞表达系统
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委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量：1
6
作者 焦翠翠 金宏丽 +15 位作者 蒋天琪 曹增国 李岭 吴芳芳 王琪 邱泊宁 迟航 黄培 侯朋飞 赵永坤 冯娜 王铁成 高玉伟 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期2114-2120,共7页
原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEE... 原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 委内瑞拉马脑炎病毒 原核表达 纯化 多克隆抗体
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马尔堡病毒糖蛋白RBD基因的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
7
作者 王琪 盖微微 +15 位作者 闫飞虎 冯娜 吴芳芳 赵梓淇 曹增国 李岭 迟航 金宏丽 邱泊宁 崔健男 赵永坤 王铁成 高玉伟 王化磊 杨松涛 夏咸柱 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期1261-1267,共7页
原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,... 原核表达并纯化马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受体结合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此为抗原免疫家兔制备抗MARV-GP-RBD多克隆抗体。参照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位区域,设计特异性引物,采用PCR方法扩增RBD基因,扩增产物经双酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a(+)-GP-RBD,转化BL21(DE3)感受态表达宿主菌,在不同条件下(时间、IPTG浓度、温度)诱导表达目的蛋白,并用His-Band N+柱进行亲和层析纯化;以纯化的重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过SDS-PAGE、Western blot和IFA鉴定重组蛋白的反应原性及免疫原性。结果显示:PCR扩增到长度为453bp的RBD基因片段;构建的重组质粒pET-30a(+)-GP-RBD经双酶切后得到与目的片段长度相同的特异性条带,测序结果显示没有突变;转化产物在培养7h、终浓度为0.4mmol/L IPTG和37℃条件下能够充分诱导目的蛋白表达,得到相对分子质量为25 000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,BCA试剂盒产量测定,每升诱导的重组菌可纯化约20mg纯度较高的目的蛋白;Western blot检测证实重组pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同时被抗His标签的单抗和兔源多抗识别并发生特异性反应,证明重组蛋白有良好的反应原性;IFA鉴定证实所制备的兔源多抗能够特异性识别表达MARV GP蛋白的重组杆状病毒rBacmid-GP-VP40,证明重组蛋白具有良好的免疫原性。结果表明:成功表达、纯化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制备,为MARV亚单位疫苗的制备和抗原、抗体检测方法的建立奠定基础。 展开更多
关键词 马尔堡病毒 糖蛋白受体结合域 原核表达与纯化 多克隆抗体
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