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动物组织冷冻切片法的改良及应用 被引量：1
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作者 潘建洪 陈秋玉 +4 位作者 邢青波 李恭贺 吴文德 刘灵康 郑喜邦 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期5520-5525,共6页
冷冻切片的优点是能完好保存有机溶剂及热敏感抗原,其缺点是制片过程中形成冰晶影响免疫组织化学检测结果。为了解决这一难题,我们对现有的冷冻切片法进行了改良。多聚甲醛固定和蔗糖脱水后的脑、肺和睾丸组织,在包埋和切片之前,利用OC... 冷冻切片的优点是能完好保存有机溶剂及热敏感抗原,其缺点是制片过程中形成冰晶影响免疫组织化学检测结果。为了解决这一难题,我们对现有的冷冻切片法进行了改良。多聚甲醛固定和蔗糖脱水后的脑、肺和睾丸组织,在包埋和切片之前,利用OCT包埋剂(聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物)进行预包埋,切片后进行苏木精伊红染色(hematoxylin eosin staining,HE染色)和免疫组织化学染色(Immunohistochemical staining,IHC染色),并比较了改良冷冻切片法、常规冷冻切片法和石蜡切片法制作的切片HE和IHC染色效果。结果显示,切片前使用OCT包埋剂充分浸润组织6~48 h,可显著地提高冷冻切片质量;与常规冷冻切片法相比,用改良法制作的睾丸和脑组织冷冻切片结构更加清晰,因冰晶形成的空洞较少,总体质量均得到极大提高;与传统石蜡切片相比,改良法制作的肺组织冷冻切片质量尤佳。本研究建立了一种适用于免疫组织化学研究的冷冻切片新方法,无需使用液氮骤冷,大幅降低了多组织样品制片的难度,并且获得了正确的IHC染色结果,从而简化了实验流程,为组织形态学研究和抗原检测提供了可靠手段。 展开更多
关键词 免疫组织化学 冷冻切片 石蜡切片
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改良背主动脉注射法对鸡胚发育与转基因表达效率的影响
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作者 韦金鱼 韦茏芹 +6 位作者 徐小明 邢青波 肖艳宇 许梦缘 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《中国畜牧杂志》 CAS 北大核心 2021年第2期191-195,共5页
背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射... 背主动脉注射是生产转基因鸡的经典方法,该方法不需换壳培养,但壳内注射技术难度大,并且无法实时观察后期胚胎发育情况。本实验对背主动脉注射法进行了改进,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺相关病毒(Adeno-associated Virus,AAV)壳外注射至150枚HH 14~16期(Hamburger-Hamilton Stage 14~16)鸡胚背主动脉中,再进行换壳培养,继续孵化至出壳,观察和分析改良背主动脉注射法与传统背主动脉注射法和胚盘下腔注射法对发育8、14、18、21 d鸡胚存活率、孵化率以及EGFP阳性检出率的影响。结果表明:改良背主动脉注射组鸡胚存活率均高于传统背主动脉注射组与胚盘下腔注射组(P<0.05或P<0.01);改良背主动脉注射组的鸡胚孵化率(37%)高于传统背主动脉注射组(16%)与胚盘下腔注射组(28%)(P<0.01);荧光蛋白手电筒检测显示,改良背主动脉注射组鸡胚EGFP阳性率(17%)明显高于传统背主动脉注射组(13%)与胚盘下腔注射组(12%)(P<0.01)。综上,背主动脉壳外注射结合换壳培养提高了转基因鸡胚胎孵化率和EGFP阳性检出率,对提高转基因鸡效率具有重要价值。 展开更多
关键词 转基因鸡 背主动脉注射 胚盘下腔注射 换壳培养 绿色荧光蛋白
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犬瘟热核衣壳蛋白原核表达及蛋白纯化
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作者 周瑶 李连燕 +8 位作者 吴磊 徐闰 刘灵康 韦茏芹 王鹏霞 韦金鱼 邢青波 徐小明 郑喜邦 《畜牧兽医杂志》 2018年第3期1-5,共5页
犬瘟热病毒(CDV)是一种单链RNA病毒,作为转录因子合成蛋白,共编码六个结构蛋白,其中核衣壳蛋白N(CDV-N)是保守性较强的免疫原性蛋白,在病毒感染时能引起强烈的抗体反应,对于CDV的诊断具有非常重要的价值。本研究的目的是构建CDV-N蛋白... 犬瘟热病毒(CDV)是一种单链RNA病毒,作为转录因子合成蛋白,共编码六个结构蛋白,其中核衣壳蛋白N(CDV-N)是保守性较强的免疫原性蛋白,在病毒感染时能引起强烈的抗体反应,对于CDV的诊断具有非常重要的价值。本研究的目的是构建CDV-N蛋白原核表达载体,利用原核表达技术纯化CDV-N蛋白。利用DNAStar软件预测CDV-N蛋白抗原表位,选择588bp截短体用于原核表达。设计引物,以本实验室保存的pMD18-T-CDV质粒为模板,PCR扩增CDV-N588片段,并将其TA克隆至pMD18-T载体。通过酶切鉴定和DNA测序,从pMD18-T-CDV-N588质粒上切取CDV-N588片段,再将其亚克隆至pET30a原核表达载体,构建重组质粒pET30a-CDV-N588。该重组质粒转化大肠杆菌BL21,ITPG在37℃诱导表达His-CDV-N588融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western Blotting加以验证。相同条件下大量增菌诱导,Ni-NTA琼脂糖珠在变性条件下分离纯化His-CDV-N588融合蛋白,再次用SDS-PAGE和Western Blotting进行验证。结果表明:pET30a-CDV-N在大肠杆菌BL21中得到高效表达;SDS-PAGE和Western Blotting检测证实,我们成功纯化了His-CDV-N588融合蛋白。本研究为制备CDV-N588蛋白单克隆抗体和研制胶体金诊断试纸条奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 核衣壳蛋白 基因克隆 原核表达 蛋白纯化
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