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LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析
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作者 豆玲 李泽轩 +5 位作者 贾訸潇 张彩云 左富江 李婷 谢元江 段晓雷 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2941-2950,共10页
【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15... 【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a;LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 mg/mL浓度的LwaCas13a蛋白。荧光检测结果显示,LwaCas13a蛋白具有明显的反式切割活性,为商业化Cas13a蛋白活性的1.25倍,且LwaCas13a蛋白与CrRNA的最佳结合比例为1∶2。【结论】试验成功表达纯化出高纯度、高浓度的LwaCas13a重组蛋白,其反式切割活性优于商业化Cas13a蛋白,并明确了该蛋白与CrRNA的最佳配比,为利用LwaCas13a进行动物病毒RNA检测新技术的研发提供了依据。 展开更多
关键词 LwaCas13a蛋白 原核表达 SUMO酶切 反式切割活性
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河南省食管癌高发区40~69岁人群食管癌筛查结果分析 被引量：1
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作者 贾訸潇 张芳 +4 位作者 胡建平 刘曙正 张萌 郭兰伟 曹小琴 《社区医学杂志》 2019年第24期1533-1535,1539,共4页
目的食管癌早期没有症状,出现症状就诊的患者基本处于晚期,预后差。本研究分析河南省食管癌高发区不同性别和年龄组人群筛查检出率和早诊率,为肿瘤早诊早治理论提供科学依据。方法选择河南省2015-2018年16个食管癌高发区筛查现场,对40~6... 目的食管癌早期没有症状,出现症状就诊的患者基本处于晚期,预后差。本研究分析河南省食管癌高发区不同性别和年龄组人群筛查检出率和早诊率,为肿瘤早诊早治理论提供科学依据。方法选择河南省2015-2018年16个食管癌高发区筛查现场,对40~69岁人群进行食管内镜下碘染色检查及指示性活检及病理学诊断。分析不同性别和年龄筛查的阳性检出率及早诊率差异。结果2015-2018年河南省共完成71601例首轮筛查,食管癌筛查阳性检出率为0.86%,早诊率为85.23%。男性食管癌筛查阳性检出率为1.07%,高于女性的0.71%,差异有统计学意义,χ~2=26.41,P<0.001,阳性检出率随年龄增加而增长,χ~2=468.43,P<0.001。男性早诊率为84.76%,女性早诊率为85.71%,两者比较差异无统计学意义,χ~2=0.11,P=0.739;各年龄组间早诊率差别亦无统计学意义,χ~2=0.24,P=0.887。结论河南省食管癌高发区40~69岁人群中不同年龄和性别食管癌阳性检出率有所不同,但早诊率无明显差别,与检出率相比,早诊率更加稳定。 展开更多
关键词 食管癌 早期诊断 早期治疗 检出率 早诊率 河南省
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