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题名利用旁侧引物提高重叠延伸PCR定点突变效率
被引量：8
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作者
王柳月
李慧美
马梦琪
梁明星
贺如阳
陈华波
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机构
湖北文理学院医学院
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出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第12期196-202,共7页
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基金
湖北省自然科学基金项目(2016CFB318)
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文摘
平行模板法简化重叠延伸PCR定点突变流程的思路不能成立,靠近DNA末端的低效限制性酶切才是制约其突变效率的核心原因。故以旁侧引物法提高DNA产物的酶切效率,增加定点突变的成功率。将上、下游引物匹配位点由两侧酶切位点外延50-100 bp,使目标基因两端的酶切位点处于第二轮PCR产物的两端近侧,而非末端。由此提高随后的酶切效率,节省反应时间。由于此时酶切会明显缩短DNA长度,凝胶电泳结果显示仅1 h就完成了对PCR产物的充分酶切。连接产物转化感受态大肠杆菌后形成的克隆数也明显增加,且阳性率由33%-70%提高至100%。经对比检测,旁侧引物法既节省了工作时间,也极大地提高了重叠延伸PCR定点突变过程中的菌落形成数与突变成功率。
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关键词
重叠延伸PCR
定点突变
旁侧引物
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Keywords
overlap extension PCR
site-directed mutagenesis
outboard-primer
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分类号
G63
[文化科学—教育学]
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题名部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变
被引量：6
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作者
肖娟
马梦琪
梁明星
贺如阳
陈华波
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机构
湖北文理学院医学院
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出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2020年第6期1232-1240,共9页
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基金
湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划(No.T201715)
湖北文理学院大学生创新创业训练计划项目(No.X201910519062)资助。
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文摘
重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。
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关键词
基因克隆
定点突变
重叠延伸PCR
视网膜母细胞瘤基因
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Keywords
gene cloning
site-directed mutagenesis
overlap extension PCR
retinoblastoma gene
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分类号
Q78
[生物学—分子生物学]
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