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食源性诺如病毒在果蔬农产品中的污染及检测研究 被引量:20
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作者 谢雅 刘贤金 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期685-697,共13页
本文综述了食源性致病微生物-诺如病毒(Norovirus,NoV)在果蔬农产品中的来源和分布、在果蔬农产品中的富集情况、与果蔬农产品相关的食源性NoV暴发情况以及在农产品中的检测方法等内容。近30年来,与农产品相关的食源性NoV暴发数目持续... 本文综述了食源性致病微生物-诺如病毒(Norovirus,NoV)在果蔬农产品中的来源和分布、在果蔬农产品中的富集情况、与果蔬农产品相关的食源性NoV暴发情况以及在农产品中的检测方法等内容。近30年来,与农产品相关的食源性NoV暴发数目持续增长。这主要与NoV的传播特性(强传染性、低感染剂量和对环境的较强抗性)以及近15年食品中NoV检测方法的显著发展有关。生鲜农产品作为高风险的食品,通常不经烹饪直接生食,在供应链中不同环节都容易被污染,如人类粪便污染的灌溉用水、肥料、食物处理用水、食物处理者的不卫生操作、交叉污染等。NoV在果蔬农产品中的结合主要与病毒颗粒的理化性质及农产品对NoV的吸附和可能的内在化途径有关。根据欧美国家与果蔬农产品有关的食源性NoV暴发的最新数据统计分析,在欧洲大规模食源性暴发主要由被NoV污染的覆盆子和生菜导致,在美国主要由被NoV污染的生菜导致。在国内,由于尚无农产品中食源性NoV检测的相关研究,缺乏与农产品相关NoV暴发的相关数据,因此无法对国内农产品中NoV的污染情况进行具体分析。农产品中NoV具有含量低且分布不均匀的特点,针对不同样品,需要采用合理的采样方法、病毒核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)提取方法以及实时荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法对其进行检测。根据NoV外壳蛋白的物化特性,高pH值和高离子强度的洗脱溶液(如碱性甘氨酸缓冲液等)可提高NoV的回收率;对于酸性水果中的病毒洗脱,加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl,Tris-HCl)可以提高回收率;莓果类中含有的果胶,可在中性条件下用果胶酶去除。本文还论述了食品中食源性NoV检测的国际标准ISO/TS 15216:2013、果蔬农产品中NoV检测方法的汇总以及检测NoV的最新方法(原位杂交RT-qPCR 展开更多
关键词 食源性 诺如病毒 果蔬农产品 污染 检测
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食品中金黄色葡萄球菌检测及防控技术研究 被引量:15
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作者 徐重新 陈蔚 +3 位作者 谢雅 林曼曼 胡晓丹 刘贤金 《农产品质量与安全》 2019年第3期49-56,共8页
金黄色葡萄球菌是威胁食品质量安全的重要生物污染物。本文在分析金黄色葡萄球菌主要生物危害风险的基础上,重点梳理了食品领域针对其检测和防控的研究现状,并结合最新研究成果,深入探讨了食品领域金黄色葡萄球菌检测和防控技术可能的... 金黄色葡萄球菌是威胁食品质量安全的重要生物污染物。本文在分析金黄色葡萄球菌主要生物危害风险的基础上,重点梳理了食品领域针对其检测和防控的研究现状,并结合最新研究成果,深入探讨了食品领域金黄色葡萄球菌检测和防控技术可能的创新思路。 展开更多
关键词 金黄色葡萄球菌 食品 质量安全 检测技术 防控技术
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Antioxidase System of a Rice Mutant with Low Chlorophyll b 被引量:11
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作者 谢雅 陈海燕 +1 位作者 张荣铣 张炜 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第3期6-10,30,共6页
[Objective] The mitigative effect of antioxidase system of a rice mutant with low chlorophyll b on photooxidative damage was studied.[Method] A rice mutant with low chlorophyll b and its wild type were taken as experi... [Objective] The mitigative effect of antioxidase system of a rice mutant with low chlorophyll b on photooxidative damage was studied.[Method] A rice mutant with low chlorophyll b and its wild type were taken as experimental materials to comparatively research their peroxide (H2O2) contents, the activity and isozymes of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) in chloroplast.[Result] Compared with the wild type, there were many kinds of SOD, POD and CAT isozymes in leaf cells and chloroplast cell of mutant, and the activity of SOD, POD and CAT isozymes in leaf cells and chloroplast cell of mutant was also correspondingly higher. Under intense light condition, the H2O2 content of chloroplast in mutant was less than that in the wild type. [Conclusion] The higher activity of scavenging active oxygen can relieve the photooxidative damage made by excessive light energy of intense light on photosynthetic membrane, which is an important reason for higher photosystem Ⅱ (PS II) stability of this mutant. 展开更多
关键词 MUTANT with LOW CHLOROPHYLL b ORYZA SATIVA Antioxidant enzyme ISOZYME pattern
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基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素LR单链抗体筛选与鉴定 被引量:8
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作者 刘媛 Huovinen Tuomas +6 位作者 刘贤金 梁颖 张存政 谢雅 贺江 王耘 张霄 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期330-337,共8页
【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌... 【目的】从鼠源合成噬菌体抗体库中,快速分离获得微囊藻毒素LR单链抗体。【方法】采用磁珠筛选和负筛选方法,设计两轮微囊藻毒素LR单链抗体的筛选方案。用噬菌体产出投入比和多克隆噬菌体免疫分析,对每轮筛选后微囊藻毒素LR特异性噬菌体的富集效果进行鉴定。再将第2轮筛选获得的次级库提取单链抗体基因,转入可溶性表达载体;诱导表达后,采用时间分辨荧光免疫法,对单个噬菌体克隆鉴定并测序。【结果】两轮筛选的噬菌体产出投入比分别为4.8×10-8和2.88×10-6。第2轮筛选后的次级库,经多克隆噬菌体免疫分析得到的荧光信噪比,比原始抗体库提高了22.8倍。最终鉴定得到5株不同的阳性噬菌体克隆,其中最佳的克隆对微囊藻毒素LR的检测灵敏度(IC10)为13 ng.mL-1,抑制中浓度(IC50)为435 ng.mL-1,线性范围在31—5 952 ng.mL-1。【结论】本研究筛选到的单链抗体,有潜力应用于微囊藻毒素LR的免疫学检测或免疫亲和柱的制备,同时也探索了一种高效的微囊藻毒素LR单链抗体的库筛选、鉴定方法。 展开更多
关键词 微囊藻毒素LR 单链抗体 时间分辨免疫分析 磁珠
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凝集素在农业和食品领域中的应用研究进展 被引量:4
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作者 徐重新 谢雅 +4 位作者 何鑫 仲建锋 刘媛 张霄 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2022年第4期1135-1144,共10页
凝集素是一类能与糖及糖类物质特异性非共价可逆结合的蛋白质或糖蛋白,广泛存在于动植物和微生物体内。部分凝集素具有抗虫、抗菌、抗病毒以及靶向识别特定微生物种类等功能,因而成为农业绿色防控和食品防腐保鲜及致病微生物筛查检测领... 凝集素是一类能与糖及糖类物质特异性非共价可逆结合的蛋白质或糖蛋白,广泛存在于动植物和微生物体内。部分凝集素具有抗虫、抗菌、抗病毒以及靶向识别特定微生物种类等功能,因而成为农业绿色防控和食品防腐保鲜及致病微生物筛查检测领域研究的热点。本文系统梳理了国内外有关凝集素在农业病虫害防控、农业生产调节、食源性致病微生物防控及筛查检测等方面的应用研究状况,并探讨了其在这些方面的应用前景、存在问题及解决问题的对策,旨在为农业绿色防控和食品防腐保鲜及农产品质量安全检测研究提供最新的文献资料和思路。 展开更多
关键词 凝集素 农作物病虫害 农业生物防控 食源性致病微生物 食品质量安全
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抗独特型抗体在食用农产品危害物监控中的应用研究 被引量:3
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作者 徐重新 张霄 +8 位作者 刘媛 胡晓丹 朱庆 仲建锋 卢丽娜 林曼曼 高美静 谢雅 刘贤金 《食品科学技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期103-110,共8页
食用农产品质量安全危害物来源广、种类多,从产地环境到农业投入品再到收储运环节,生物、化学污染物危害风险几乎伴随整个产供链。对危害物的高效监测,以及探索更为安全的危害物(特别是高毒投入品)替代功能效应物是食用农产品质量安全... 食用农产品质量安全危害物来源广、种类多,从产地环境到农业投入品再到收储运环节,生物、化学污染物危害风险几乎伴随整个产供链。对危害物的高效监测,以及探索更为安全的危害物(特别是高毒投入品)替代功能效应物是食用农产品质量安全监控可持续发展的必然要求。基于“免疫网络学说”的抗独特型抗体,因具有模拟抗原表位构象乃至生物活性的特性,已被证实可以用于免疫原功能效应物创制,这为食用农产品质量安全危害物检测或功能替代材料研发提供了新思路。系统梳理了食用农产品产供过程中可能涉及的危害物及其安全风险;全面整理并介绍了抗独特型抗体技术及其在食用农产品质量安全危害物监控中的应用状况;结合作者及所在团队近年科研成果,探讨了抗独特型抗体在食用农产品质量安全危害物监控中的应用前景、存在问题以及拟解决对策。 展开更多
关键词 抗独特型抗体 食用农产品 质量安全 免疫分析 生物防控
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靶向模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的人源化基因工程抗体筛选及鉴定 被引量:2
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作者 徐重新 张霄 +5 位作者 刘媛 仲建锋 谢雅 卢莉娜 高美静 刘贤金 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期191-200,共10页
Bt蛋白制剂及其转基因作物长时间推广应用,害虫抗药性等问题日益凸显,探索新型安全抗虫材料已成为竞先研究的热点。基于抗体免疫网络学说的抗独特型抗体技术被证实可用于研发抗原生物活性类似物,有望成为靶向创制模拟Bt蛋白抗虫功能材... Bt蛋白制剂及其转基因作物长时间推广应用,害虫抗药性等问题日益凸显,探索新型安全抗虫材料已成为竞先研究的热点。基于抗体免疫网络学说的抗独特型抗体技术被证实可用于研发抗原生物活性类似物,有望成为靶向创制模拟Bt蛋白抗虫功能材料的新途径。以Bt Cry1C蛋白多克隆抗体为包被抗原,从人源化噬菌体单链抗体库中获得9个阳性单克隆,其中E8-Anti-Id scFv经鉴定为β型抗独特型基因工程单链抗体。Bt Cry1C蛋白多克隆抗体、小菜蛾(Plutella xylostella)刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)蛋白和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)BBMV蛋白对E8-Anti-Id scFv的竞争抑制中浓度(IC_(50))分别为2.625、3.638和4.605μg/mL。室内生物测定显示,噬菌体展示形式的E8-Anti-Id scFv在滴度为1.2×10^(8) CFU/mL浓度条件下,对供试的小菜蛾和稻纵卷叶螟在72 h内的校正死亡率为58.69%和52.82%,其抗虫活性分别达到浓度为20μg/mL的原Bt Cry1C蛋白的77.87%和73.21%。由此表明,获得的E8抗独特型基因工程单链抗体材料初步具备模拟Bt Cry1C蛋白抗虫功能的特性,为后期深入研究和推进应用奠定了技术和材料基础。 展开更多
关键词 Bt Cry1C蛋白 抗独特型抗体 噬菌体抗体库 基因工程抗体
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小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟 被引量:2
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作者 张霄 胡晓丹 +6 位作者 仲建锋 武爱华 徐重新 刘媛 张存政 谢雅 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第23期4555-4565,共11页
【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素... 【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热� 展开更多
关键词 碱性磷酸酯酶 原核表达 配体印迹 同源建模 分子对接 热点残基预测
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青杂5号甘蓝型油菜的高效再生及农杆菌侵染转化体系的建立 被引量:2
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作者 谢雅 武爱华 刘贤金 《江苏农业科学》 北大核心 2015年第12期17-22,共6页
以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种青杂5号的子叶、下胚轴外植体为受体,分别对芽分化培养基、芽生长培养基、生根培养基进行激素组合优化研究,建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生系统。结果表明,青杂5号下胚轴分化率最高为子叶的3倍,可达... 以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种青杂5号的子叶、下胚轴外植体为受体,分别对芽分化培养基、芽生长培养基、生根培养基进行激素组合优化研究,建立甘蓝型油菜下胚轴高效再生系统。结果表明,青杂5号下胚轴分化率最高为子叶的3倍,可达90%左右;优化的分化培养基为MSB+5 mg/L噻二唑苯基脲(thidiazuron,TDZ)+7.5 mg/L Ag NO3+0.1 mg/L NAA+2 mg/L脯氨酸(proline,L-Pro)+250 mg/L酸水解酪蛋白(casein acid hydrolysate,CH)+3%蔗糖;生长培养基为1/2 MSB+1 mg/L IBA+2 mg/L L-Pro+250 mg/L CH+1.5%蔗糖;生根培养基为1/2 MSB+0.2 mg/L IAA+1.5%蔗糖。在此基础上,构建模拟Bt的抗虫基因B12的双元表达载体,采用农杆菌介导的方法转化油菜下胚轴,并利用潮霉素及羧苄青霉素对再生植株进行筛选;通过对转基因植株叶片基因组DNA的PCR检测及叶片GUS组织化学染色的分析,发现抗虫基因已整合到油菜植株的细胞核基因组中,并能正常表达;通过小菜蛾接种试验对该抗虫基因进行杀虫效果评价。 展开更多
关键词 甘蓝型油菜 下胚轴高效再生 农杆菌介导转化 抗虫基因 GUS染色 转基因植株
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对行化疗的胃癌患者实施整体护理的效果研究 被引量:2
10
作者 谢雅 《当代医药论丛》 2016年第8期56-57,共2页
目的:探讨对进行化疗的胃癌患者实施整体护理的临床效果。方法:对2013年6月至2014年12月期间在我院进行化疗的64例胃癌患者的临床资料进行回顾性研究。我们按照随机数表法将这64例患者分为整体组和常规组,每组各有32例患者。在这两组患... 目的:探讨对进行化疗的胃癌患者实施整体护理的临床效果。方法:对2013年6月至2014年12月期间在我院进行化疗的64例胃癌患者的临床资料进行回顾性研究。我们按照随机数表法将这64例患者分为整体组和常规组,每组各有32例患者。在这两组患者进行化疗期间,为常规组患者应用常规护理模式进行护理,在此基础上,为整体组患者应用整体护理模式进行护理。护理结束后,比较两组患者治护的效果、社会功能、心理功能、躯体功能、认知功能、角色功能的评分、接受护理前后其SAS(焦虑自评量表)的评分、SDS(抑郁自评量表)的评分和对护理服务的总满意率。结果:护理结束后,两组患者SAS的评分和SDS的评分均较接受护理前有明显的下降,其中整体组患者接受护理后其SAS的评分和SDS的评分均明显低于常规组患者,二者相比差异具有显著性(P<0.05)。整体组患者治护的总有效率、社会功能、心理功能、躯体功能、认知功能、角色功能的评分和对护理服务的总满意率均明显高于常规组患者,二者相比差异具有显著性(P<0.05)。结论:对进行化疗的胃癌患者实施整体护理的临床效果确切,可有效地改善其生活质量,缓解其不良情绪,提高其对护理服务的满意度。 展开更多
关键词 胃癌 化疗 整体护理 临床效果 生活质量
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Cry2Aa毒素结合十二肽的筛选与鉴定 被引量:2
11
作者 武爱华 张霄 +5 位作者 刘媛 赵扬 赵岩岩 张存政 谢雅 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第4期929-941,共13页
利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特... 利用Cry-2Aa毒素蛋白对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮筛选,并从第4轮筛选产物中随机挑选20个单克隆,进行单克隆ELISA、PCR扩增、DNA电泳及测序,鉴定这些克隆与Cry2Aa毒素的结合活性。结果显示,这20个克隆均能与c巧也Aa毒素发生特异性结合,并推导出8条不同的序列。挑取阳性值最高的克隆GT(氨基酸序列为GTPWHHHRHLIV)建立了基于十二肽的Cry-2Aa毒蛋白的间接竞争ELISA检测方法。该方法的抑制中浓度(IC50)为1|1390μg/ml,最低检测限IC10为O.0211μg/ml,线性检测范围为0.0478~22.691Oμg/ml(Y=23.09lgx+48.692,R^2=0.9963)。噬菌体展示肽库筛选方法为快速、准确地检测Cry2Aa毒蛋白提供了新的途径。 展开更多
关键词 Cry2Aa毒素 噬菌体展示肽库:ELISA
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事业单位财务风险识别与控制对策研究 被引量:2
12
作者 谢雅 《商业2.0(经济管理)》 2022年第5期0148-0150,共3页
事业单位财务内部控制对于财务管理工作乃至事业单位发展都起着至关重要的影响。事业单位在财务内部控制方面出现了很多新问题和新情况,事业单位主要领导必须树立信息化思维,积极推动事业单位财务内部控制信息化建设,对财务内部控制制... 事业单位财务内部控制对于财务管理工作乃至事业单位发展都起着至关重要的影响。事业单位在财务内部控制方面出现了很多新问题和新情况,事业单位主要领导必须树立信息化思维,积极推动事业单位财务内部控制信息化建设,对财务内部控制制度机制进行完善和创新。新形势下,既要看到事业单位财务内部控制出现的新情况和新问题,也要主动地引进现代信息技术,对事业单位财务内部控制方式、方法、理念进行创新,完善相应制度机制,构建严密的监督体系,加强人才队伍建设,进一步提升事业单位财务内部控制效果,更好的服务事业单位发展。 展开更多
关键词 事业单位 财务风险 识别 控制
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亲和短肽用于快速检测转基因蛋白Cry3Bb 被引量:1
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作者 王耘 武爱华 +3 位作者 刘贤金 谢雅 闫娜 张存政 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第3期690-694,共5页
本研究利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽,以此建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法(IC-ELISA)。经过4轮淘选、富集,获得与靶蛋白具有较高亲和力的B10克隆(ACIHSPTALCGGG)。所建立的检测方法稳定性较好,变异系数在5%... 本研究利用竞争洗脱法淘选与Cry3Bb毒素具有亲和力的特异性短肽,以此建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法(IC-ELISA)。经过4轮淘选、富集,获得与靶蛋白具有较高亲和力的B10克隆(ACIHSPTALCGGG)。所建立的检测方法稳定性较好,变异系数在5%以内;线性检测范围为0.03~29.95μg/ml,线性回归方程为(Y=20.044x+50.407,R2=0.983 4),检测限为0.009 6μg/ml,在玉米样品中提取回收率为92.26%~101.22%。本研究所建立的ELISA检测方法为粮食中Cry3Bb蛋白的定量检测提供了有效的手段,在转基因产品的检验检疫中有较高的应用价值。 展开更多
关键词 Cry3Bb毒素 转基因植物 噬菌体展示肽 间接竞争ELISA
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低叶绿素b水稻突变体的抗氧化酶系统研究
14
作者 谢雅 陈海燕 +1 位作者 张荣铣 张炜 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第27期11650-11652,11657,共4页
[目的]研究低叶绿素b水稻突变体抗氧化酶系统在缓解光氧化伤害中的作用。[方法]以低叶绿素b水稻突变体和野生型为材料,对其叶绿体中过氧化氢(H2O2)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性和同工酶谱进行... [目的]研究低叶绿素b水稻突变体抗氧化酶系统在缓解光氧化伤害中的作用。[方法]以低叶绿素b水稻突变体和野生型为材料,对其叶绿体中过氧化氢(H2O2)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性和同工酶谱进行了比较。[结果]与野生型相比,突变体叶片细胞及叶绿体中抗氧化酶SOD、POD和CAT的同工酶种类相对较多,酶活性相对较高;强光条件下,突变体叶绿体H2O2的含量低于野生型叶绿体。[结论]较强的内源活性氧清除系统减轻了强光下过剩光能对光合膜的光氧化伤害,是该突变体PSII具有较高稳定性的重要原因。 展开更多
关键词 低叶绿素b含量突变体 水稻(OryzasativaL.) 抗氧化酶 同工酶谱
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抗Bt(Cry1B)毒素单链抗体在sf9昆虫细胞中的表达及活性测定 被引量:1
15
作者 徐重新 张霄 +4 位作者 张存政 刘媛 谢雅 黄鹰 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期985-991,共7页
通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒... 通过构建pFastBacTM HT-A-scFv重组质粒,并将重组质粒化转DH10BacTM Escherichia coli感受态细胞,进行蓝白斑筛选,获得阳性克隆.PCR和基因测序检测证实挑取的白斑阳性单克隆存在完整、正确的单链抗体基因.提取阳性克隆中的重组杆状病毒穿梭载体(Bacmid-scFv)侵染sf9昆虫细胞,细胞发生明显病变特征.通过SDS-PAGE、Western blotting和间接竞争性ELISA等方法检测,发现单链抗体在sf9昆虫细胞中表达成功,测得纯化后蛋白浓度为103.000 0 μg/ml,Cry1B毒素对单链抗体的抑制中浓度(IC50)为1.010 0 μg/ml,最低检测线IC10为0.011 3μg/ml,线性检测范围为0.500 0~10.000 0 μg/ml.可溶性scFv对抗原类似物无交叉反应. 展开更多
关键词 Cry1B毒素 单链抗体 真核表达系统 酶联免疫分析
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苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白cry2Ad2原核表达及其不同长度片段产物的杀虫活性 被引量:1
16
作者 谢雅 冯纪年 +3 位作者 张存政 王耘 赵龙龙 刘贤进 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期1242-1248,共7页
该研究采用NCBI蛋白分析软件对Cry2Ad2蛋白序列进行分析,采用PCR克隆获得3种不同长度的cry2Ad2及全长cry2Ad2基因片段,并将这些基因片段克隆到pET-26b载体上,构建重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3,再导入大肠杆菌BL21(DE3)中... 该研究采用NCBI蛋白分析软件对Cry2Ad2蛋白序列进行分析,采用PCR克隆获得3种不同长度的cry2Ad2及全长cry2Ad2基因片段,并将这些基因片段克隆到pET-26b载体上,构建重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3,再导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行细胞周质诱导表达,并采用室内生物测定法测定表达产物对小菜蛾的毒力。Cry2Ad2蛋白的序列分析结果表明:全长的Cry2Ad2蛋白包含两个保守区域domain I(第53位~第264位氨基酸)和domainⅡ(第267位~第472位氨基酸),推测保守活性片段C端末端在N-端的第472位与第633位氨基酸之间。重组质粒pET-Ad、pET-Ad1、pET-Ad2和pET-Ad3在大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳验证分别含有约70 000、52 000、51 000和54 000的表达蛋白。生物活性初步测定结果表明:表达的Cry2Ad2、Cry2Ad2-1、Cry2Ad2-2及Cry2Ad2-3给药72 h后对小菜蛾都具有杀虫活性,其中蛋白Cry2Ad2、Cry2Ad2-2与Cry2Ad2-3对小菜蛾有较强的毒性,相同剂量致死率分别为64.35%、53.27%和61.66%,统计分析表明蛋白Cry2Ad2-1与Cry2Ad2-3的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率无显著差异,(P>0.05);蛋白Cry2Ad2-2对小菜蛾的毒力相对较低,相同剂量致死率为39.89%,蛋白Cry2Ad2-2的致死率与蛋白Cry2Ad2的致死率差异显著(P<0.05)。鉴此,初步推断Cry2Ad2蛋白对小菜蛾的活性区在第49位与第463位氨基酸之间。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 Cry2Ad2蛋白 活性区 小菜蛾
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抗Cry1F毒素单链抗体的筛选及初步应用 被引量:1
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作者 徐重新 张存政 +6 位作者 何鑫 张留娟 张霄 仲建锋 刘媛 谢雅 刘贤金 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期1166-1172,共7页
对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,... 对扩增的Tomlinson I噬菌体抗体库进行3轮特异性富集,挑取单菌落,采用ELISA、PCR及测序比对分析鉴定阳性噬菌体单链抗体(sc Fv);以宿主替换的方式将阳性噬菌体sc Fv基因导入Escherichia coli HB2151中进行可溶性表达,sc Fv过柱纯化后,建立针对Cry1 F毒素的IC-ELISA检测方法。以Cry1 B、Cry1 C、Cry1 Ab、Cry1 Ac作为竞争抑制物,分析sc Fv的特异性,以Cry1 F毒素在玉米中的添加回收试验评价检测方法的实用性。结果显示,从第3轮富集库中筛选到了11株具有Cry1F毒素结合活性的噬菌体sc Fv菌株,经PCR鉴定都含有目的条带,对其中2株(H1、G9)进行测序,证实为人源化的sc Fv。选取G9号阳性噬菌体sc Fv进行可溶性表达,纯化后收集到的sc Fv浓度为256μg/ml。建立的IC-ELISA检测方法检测灵敏度(IC10)为5.99 ng/ml,抑制中浓度(IC50)为0.410μg/ml,线性检测范围(IC20~IC80)为0.107~0.713μg/ml。sc Fv(G9)对Cry1B、Cry1C具有一定结合活性,交叉反应率分别达到了20.92%和15.59%,但不识别Cry1Ab和Cry1Ac,交叉反应率均低于0.1%。添加回收试验结果表明,基于sc Fv(G9)建立的IC-ELISA检测方法稳定性和重复性都比较好。 展开更多
关键词 苏云金芽孢杆菌 Cry1F毒素 单链抗体 酶联免疫分析
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基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定 被引量:1
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作者 张留圈 张霄 +5 位作者 刘媛 徐重新 张存政 谢雅 寇莉萍 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期1802-1810,共9页
【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cr... 【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为"捕获抗体",多抗为"检测抗体",建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25—2.43μg·mL-1线性检测范围内,� 展开更多
关键词 磁珠 Cry1Ac毒素 单链抗体 双抗夹心ELISA
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Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定 被引量:1
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作者 刘贝贝 张霄 +6 位作者 谢雅 焦凌霞 刘媛 张存政 赵岩岩 武爱华 刘贤金 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第16期3130-3139,共10页
【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5... 【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L^(-1)的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在� 展开更多
关键词 BT Cry1类毒素 共性结构域 原核表达 纯化
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环保建议书
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作者 谢雅 《小学生作文选刊(中高年级)》 2016年第10期36-37,共2页
尊敬的县长叔叔:您好!“蓝天是白云的家,森林是鸟儿的家,河流是鱼儿的家,泥土是种子的家,美丽的安溪就是我的家!”安溪,人杰地灵、山水秀美,我生在这儿,长在这儿,已被这里迷人的景色深深吸引住了。清晨,微风徐徐,三三两两的老人在湖边... 尊敬的县长叔叔:您好!“蓝天是白云的家,森林是鸟儿的家,河流是鱼儿的家,泥土是种子的家,美丽的安溪就是我的家!”安溪,人杰地灵、山水秀美,我生在这儿,长在这儿,已被这里迷人的景色深深吸引住了。清晨,微风徐徐,三三两两的老人在湖边怡然自得地散步;傍晚,华灯初上,几条游船在湖面上漂荡;雁塔旁边歌声阵阵,三五成群的人随着音乐翩翩起舞。在这个人间仙境里,不管你有多少烦恼,都会烟消云散。 展开更多
关键词 我生 安溪 人间仙境 上漂 雁塔 买东西 警示牌 可回收垃圾 不文明现象 节约用水
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